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暴力曹銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
在做環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增lamp，有些想法和問(wèn)題想和大家交流請(qǐng)教一下，請(qǐng)前輩們多多指教~
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這段時(shí)間在做這方面的實(shí)驗(yàn)，有些問(wèn)題有些不明白，請(qǐng)各位多指教~ 問(wèn)題一，引物是直接在線網(wǎng)頁(yè)版設(shè)計(jì)的，開始用PCR儀做的溫度梯度，在61~65這個(gè)范圍擴(kuò)增效果都很好，反應(yīng)1h；前期在干浴鍋上65反應(yīng)1h就能明顯看到沉淀，電泳條帶也不錯(cuò)，但后來(lái)這段時(shí)間要么經(jīng)常擴(kuò)不出來(lái)，或者是需要延長(zhǎng)擴(kuò)增時(shí)間才可以，體系條件是完全一樣的，而且從61到65都試過(guò)，有點(diǎn)疑惑。這種情況是什么原因，酶是新的，內(nèi)引物也是隔一段時(shí)間就更新，會(huì)不會(huì)是因?yàn)橥庖飼r(shí)間長(zhǎng)了造成的？ 問(wèn)題二，關(guān)于反應(yīng)結(jié)果的判定，用SYBR Green I做染色劑，在反應(yīng)結(jié)束后加入觀察熒光，這個(gè)做的還比較順利，就是想可不可以在實(shí)驗(yàn)一開始就加入染料，然后直接反應(yīng)結(jié)束觀察熒光情況就好，這樣可以避免污染，不知道可不可行，改天做個(gè)實(shí)驗(yàn)看看； 問(wèn)題三，關(guān)于鈣黃綠素做染色劑，和氯化錳都是直接從生工拿的國(guó)產(chǎn)的，便宜得很，但效果還可以，問(wèn)題其實(shí)和一有點(diǎn)相同，就是現(xiàn)在反應(yīng)時(shí)間要90min才能明顯反應(yīng)產(chǎn)生熒光，會(huì)不會(huì)是這兩個(gè)試劑對(duì)酶活有影響，造成反應(yīng)減慢？這里面還有個(gè)小教訓(xùn)分享一下，一般DNA是用水溶的，當(dāng)時(shí)為了更長(zhǎng)時(shí)間保存，用TE溶解的，結(jié)果反應(yīng)體系每次在加入模板后就立馬有熒光了，很囧，折騰了好久才想到原因。。。 問(wèn)題四，在nature的文章里看到體系又加甜菜堿和tween20，我現(xiàn)在的體系都沒(méi)加這兩種，其作用大么？ 問(wèn)題五，環(huán)引物是不是會(huì)提高擴(kuò)增速度，具體該怎么設(shè)計(jì)？ 有點(diǎn)多，諸位大神多指教~ |
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暴力曹
銀蟲 (初入文壇)
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2樓2014-07-04 12:22:08
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鄭傳益
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想請(qǐng)教一下為什么我加入了SYBR green I稀釋到100×的加入后，在紫外燈下有引物都會(huì)顯色，你是怎么加入，陰性沒(méi)有顏色的。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2017-09-10 23:16:01
15112009180
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9樓2017-10-14 15:16:11
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10樓2017-10-14 15:18:15
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