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暴力曹銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
在做環(huán)介導等溫擴增lamp，有些想法和問題想和大家交流請教一下，請前輩們多多指教~
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這段時間在做這方面的實驗，有些問題有些不明白，請各位多指教~ 問題一，引物是直接在線網(wǎng)頁版設(shè)計的，開始用PCR儀做的溫度梯度，在61~65這個范圍擴增效果都很好，反應(yīng)1h；前期在干浴鍋上65反應(yīng)1h就能明顯看到沉淀，電泳條帶也不錯，但后來這段時間要么經(jīng)常擴不出來，或者是需要延長擴增時間才可以，體系條件是完全一樣的，而且從61到65都試過，有點疑惑。這種情況是什么原因，酶是新的，內(nèi)引物也是隔一段時間就更新，會不會是因為外引物時間長了造成的？ 問題二，關(guān)于反應(yīng)結(jié)果的判定，用SYBR Green I做染色劑，在反應(yīng)結(jié)束后加入觀察熒光，這個做的還比較順利，就是想可不可以在實驗一開始就加入染料，然后直接反應(yīng)結(jié)束觀察熒光情況就好，這樣可以避免污染，不知道可不可行，改天做個實驗看看； 問題三，關(guān)于鈣黃綠素做染色劑，和氯化錳都是直接從生工拿的國產(chǎn)的，便宜得很，但效果還可以，問題其實和一有點相同，就是現(xiàn)在反應(yīng)時間要90min才能明顯反應(yīng)產(chǎn)生熒光，會不會是這兩個試劑對酶活有影響，造成反應(yīng)減慢？這里面還有個小教訓分享一下，一般DNA是用水溶的，當時為了更長時間保存，用TE溶解的，結(jié)果反應(yīng)體系每次在加入模板后就立馬有熒光了，很囧，折騰了好久才想到原因。。。 問題四，在nature的文章里看到體系又加甜菜堿和tween20，我現(xiàn)在的體系都沒加這兩種，其作用大么？ 問題五，環(huán)引物是不是會提高擴增速度，具體該怎么設(shè)計？ 有點多，諸位大神多指教~ |
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15112009180
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