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電轉(zhuǎn)影響因素及原理 已有3人參與
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影響電轉(zhuǎn)的因素及如何影響的，已經(jīng)電轉(zhuǎn)了很多次還是沒有克隆長出來，想了解下一些影響因素及原理，然后好去繼續(xù)實驗 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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你怎么知道是沒轉(zhuǎn)進去呢？不管是電轉(zhuǎn)還是化轉(zhuǎn)，效率都很高啊。不知道你的目的蛋白是什么，你可以試著換一下涂板的培養(yǎng)基。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
10樓2017-08-02 13:23:13
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+6, MolEPI+1, 鼓勵回帖交流 2017-08-02 07:45:31
感謝參與，應助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+6, MolEPI+1, 鼓勵回帖交流 2017-08-02 07:45:31
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電轉(zhuǎn)原理： 電轉(zhuǎn)化法是利用瞬間高壓在細胞上打孔，因而需用冰冷的超純水多次洗滌處于對數(shù)生長前期的細胞，以使細胞懸浮液中應含有盡量少的導電離子。轉(zhuǎn)化效率為109～1010 轉(zhuǎn)化子/礸 DNA；對于熱激法，是利用冰冷的CaCl2處理對數(shù)生長期的細胞，可以誘導其產(chǎn)生短暫的“感受態(tài)‘，易于攝取外源DNA。轉(zhuǎn)化效率為106 ～107轉(zhuǎn)化子/礸 DNA。 影響因素： ⑴、細胞的生長狀態(tài)和密度 最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。不要用已 經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接，及貯存在4℃的培養(yǎng)菌液。細胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細胞數(shù)在5×107個左右為佳。即應用對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細菌，可通過測定培養(yǎng)液的OD600控制。對TG1菌株，OD600為0.5時，細胞密度在5×107個/ml左右。(應注意OD600值與細胞數(shù)之間的關系隨菌株的不同而不同)。密度過高或不足均會使轉(zhuǎn)化率下降。 此外，受體細胞一般應是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并且受體細胞還應與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。 ⑵、質(zhì)粒dna的質(zhì)量和濃度 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時，則會使轉(zhuǎn)化率下降。一般地，DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受態(tài)細胞達到飽和。 對于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低，實驗證明，大于30kb的重組質(zhì)粒將很難進行轉(zhuǎn)化。此外，重組DNA分子的構型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10~100倍，因此重組DNA大都構成環(huán)狀雙螺旋分子。 ⑶、試劑的質(zhì)量 所用的CaCl2等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于4℃。 ⑷、防止雜菌和雜DNA的污染 整個操作過程均應在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。 ⑸、整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴，否則細胞轉(zhuǎn)化率將會降低。 |
2樓2017-08-01 22:38:46
3樓2017-08-01 23:23:46
上一條不小心發(fā)出去了 一樓CaCl2都出來了 這是電轉(zhuǎn) 哪來的CaCl2啊 講道理電轉(zhuǎn)的效率一般情況下很高 樓主最好把感受態(tài)制備和電轉(zhuǎn)流程寫一下 這樣便于別人找問題在哪里哦 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
4樓2017-08-01 23:26:32
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