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yudaoqian88至尊木蟲 (知名作家)
不良人
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[求助]
氨芐抗性的PUC18-3HA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101問題 已有2人參與
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又來求助了 如題，要證明轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的調(diào)控，采用pGREEN2-0800-LUC/REN雙熒光系統(tǒng)，轉(zhuǎn)錄因子是構(gòu)建到了PUC18-3HA載體上，是amp抗性的。按照操作要轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，第一次抗性弄錯了，沒長，第二次用amp，整個板子都是，和抗生素失效的感覺一樣，也查詢了一下，似乎確實有人遇到這樣的問題。 接下來要轉(zhuǎn)的話，是要提高抗生素濃度呢，還是更換農(nóng)桿菌菌株？請過來人指點一二，謝謝。下面是粘貼其他人的資源： 標(biāo)題: 請問有人將氨芐抗性的表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌嗎？用的是哪種農(nóng)桿菌呀？ 摘要: [請問有人將氨芐抗性的表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌嗎？用的是哪種農(nóng)桿菌呀？] 我把氨芐抗性的表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105、GV3103中，結(jié)果12小時就都長了滿滿一板子，然后又試了下LBA4404，結(jié)果又不長。哪位大俠做過的話指導(dǎo)下我吧，我的煙草眼看就不能注射了！ 關(guān)鍵詞:[抗性 農(nóng)桿菌 表達載體 載體 菌株 實驗室 質(zhì)粒]…… 關(guān)鍵詞: 抗性 農(nóng)桿菌 表達載體 載體 菌株 實驗室 質(zhì)粒 我把氨芐抗性的表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105、GV3103中，結(jié)果12小時就都長了滿滿一板子，然后又試了下LBA4404，結(jié)果又不長。哪位大俠做過的話指導(dǎo)下我吧，我的煙草眼看就不能注射了！ 回復(fù) 試試GV3101、EHA103看吧。不是很清楚。 回復(fù) 看質(zhì)粒有沒有整合區(qū)。沒有的話要用90RK菌株用三抗篩選。氨芐 最好換成羧卞，加利福平 慶大霉素，我記得這個菌株有兩個也不三個抗性。有點記不清了 這個菌株很難做，樓主再查查 。 回復(fù) 我們實驗室也轉(zhuǎn)化過氨芐抗性的，確實板會長的沒法用，后來我們都改用卡納抗性的載體了 回復(fù) 我們實驗室也轉(zhuǎn)化過氨芐抗性的，確實板會長的沒法用，后來我們都改用卡納抗性的載體了 不要這樣啊，這不是要重做的節(jié)奏嘛，我好不容易做好的載體  回復(fù) A4用了嗎 沒太看懂什么意思 回復(fù) 我們DH5a用的AMP,GV3101用的KANA,RIF,CARB,Mgcl2. 回復(fù) 用EHA105 將氨芐濃度提高四倍可以篩選出來。 回復(fù) 用EHA105 將氨芐濃度提高四倍可以篩選出來。 我正在做這種嘗試，希望有用呀 回復(fù) 我們DH5a用的AMP,GV3101用的KANA,RIF,CARB,Mgcl2. 謝謝你，我借個GV3101試試。 回復(fù) 謝謝你，我借個GV3101試試。... |
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【答案】應(yīng)助回帖
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這個問題我曾經(jīng)也遇到過，當(dāng)時以為是有污染什么的，但是轉(zhuǎn)了幾次都是這樣。 我認為8樓說的有道理。 |
yudaoqian8812樓2017-02-17 15:08:23
Lau_Kimura
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2017-02-14 07:45:54
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2017-02-14 07:45:54
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管它長多長少，有沒有挑菌做菌落PCR驗證，看有沒有轉(zhuǎn)進去。你驗證過是不是假陽性了嗎？ 要驗證抗生素是否失效，可以直接用感受態(tài)涂板，作為陰性對照的。 新手做實驗?zāi)哪懿辉O(shè)計對照組的呢？你老板知道看打不打死你。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
2樓2017-02-14 03:32:12
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正在學(xué)習(xí)這方面的:請問是不是還要設(shè)計個不含有AMP的培養(yǎng)基作為對照啊，還是需要設(shè)計個同時含有X-Gal��？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
3樓2017-02-14 05:03:39
yudaoqian88: 回帖置頂 2017-02-14 09:54:14
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amp容易變壞，要新鮮配置，不能太多水汽。有一個amp替代物，carbenicilin 以后可以嘗試 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
4樓2017-02-14 07:44:48
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