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yudaoqian88至尊木蟲 (知名作家)
不良人
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[求助]
氨芐抗性的PUC18-3HA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101問題 已有2人參與
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又來求助了 如題，要證明轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的調(diào)控，采用pGREEN2-0800-LUC/REN雙熒光系統(tǒng)，轉(zhuǎn)錄因子是構(gòu)建到了PUC18-3HA載體上，是amp抗性的。按照操作要轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，第一次抗性弄錯了，沒長，第二次用amp，整個板子都是，和抗生素失效的感覺一樣，也查詢了一下，似乎確實有人遇到這樣的問題。 接下來要轉(zhuǎn)的話，是要提高抗生素濃度呢，還是更換農(nóng)桿菌菌株？請過來人指點一二，謝謝。下面是粘貼其他人的資源： 標(biāo)題: 請問有人將氨芐抗性的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌嗎？用的是哪種農(nóng)桿菌呀？ 摘要: [請問有人將氨芐抗性的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌嗎？用的是哪種農(nóng)桿菌呀？] 我把氨芐抗性的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105、GV3103中，結(jié)果12小時就都長了滿滿一板子，然后又試了下LBA4404，結(jié)果又不長。哪位大俠做過的話指導(dǎo)下我吧，我的煙草眼看就不能注射了！ 關(guān)鍵詞:[抗性 農(nóng)桿菌 表達(dá)載體 載體 菌株 實驗室 質(zhì)粒]…… 關(guān)鍵詞: 抗性 農(nóng)桿菌 表達(dá)載體 載體 菌株 實驗室 質(zhì)粒 我把氨芐抗性的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105、GV3103中，結(jié)果12小時就都長了滿滿一板子，然后又試了下LBA4404，結(jié)果又不長。哪位大俠做過的話指導(dǎo)下我吧，我的煙草眼看就不能注射了！ 回復(fù) 試試GV3101、EHA103看吧。不是很清楚。 回復(fù) 看質(zhì)粒有沒有整合區(qū)。沒有的話要用90RK菌株用三抗篩選。氨芐 最好換成羧卞，加利福平 慶大霉素，我記得這個菌株有兩個也不三個抗性。有點記不清了 這個菌株很難做，樓主再查查 。 回復(fù) 我們實驗室也轉(zhuǎn)化過氨芐抗性的，確實板會長的沒法用，后來我們都改用卡納抗性的載體了 回復(fù) 我們實驗室也轉(zhuǎn)化過氨芐抗性的，確實板會長的沒法用，后來我們都改用卡納抗性的載體了 不要這樣啊，這不是要重做的節(jié)奏嘛，我好不容易做好的載體  回復(fù) A4用了嗎 沒太看懂什么意思 回復(fù) 我們DH5a用的AMP,GV3101用的KANA,RIF,CARB,Mgcl2. 回復(fù) 用EHA105 將氨芐濃度提高四倍可以篩選出來。 回復(fù) 用EHA105 將氨芐濃度提高四倍可以篩選出來。 我正在做這種嘗試，希望有用呀 回復(fù) 我們DH5a用的AMP,GV3101用的KANA,RIF,CARB,Mgcl2. 謝謝你，我借個GV3101試試。 回復(fù) 謝謝你，我借個GV3101試試。... |
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西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵回帖交流 2017-02-15 07:53:51
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我不常上小木蟲，但是，每當(dāng)我看到有人問類似的問題，我就有點擔(dān)憂。 按理說，導(dǎo)師應(yīng)該是學(xué)生的指導(dǎo)人，是有一定學(xué)術(shù)水平、有過科班訓(xùn)練、發(fā)表過有一定水準(zhǔn)的SCI論文、并且能夠提供有益的指導(dǎo)、避免缺少或者無經(jīng)驗的學(xué)生或下屬走彎路的帶頭人�？上�，國內(nèi)外，有很多導(dǎo)師并不稱職，并不配作為碩士或博士導(dǎo)師，科研已經(jīng)成為個人撈取名利的手段，全無應(yīng)有的風(fēng)度與做派。導(dǎo)致師生反目、學(xué)生厭學(xué)或抑郁的事情，常有發(fā)生。所以，學(xué)生選導(dǎo)師，不要看稱號、不要看學(xué)校，而要看導(dǎo)師本身的水準(zhǔn)與實驗室條件以及人品。即使你是哈佛畢業(yè)的，沒有獨立一作的拿得出手的論文，你照樣沒法在科研領(lǐng)域里生存。 早些年，只要你是所謂的名校畢業(yè)的，沒有本事的混混也能拿到好待遇，現(xiàn)在是：不以出身論英雄，也算是一點進(jìn)步，給底層一點鼓勵吧。 我想說的是，從你的載體名可以看出，我猜失敗的主要的原因是：你用的是原生質(zhì)表達(dá)用的pUC載體，并不含有T-DNA區(qū)等農(nóng)桿菌載體的特點，故不能在農(nóng)桿菌里使用。正確的是更換effector質(zhì)粒為pCAMBIA系列的質(zhì)粒或者pBI121系列的質(zhì)粒。我實驗室的學(xué)生幾年過犯過一個類似的錯誤，被我及時發(fā)現(xiàn)阻止了。 |
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8樓2017-02-14 22:43:21
Lau_Kimura
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2017-02-14 07:45:54
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2017-02-14 07:45:54
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管它長多長少，有沒有挑菌做菌落PCR驗證，看有沒有轉(zhuǎn)進(jìn)去。你驗證過是不是假陽性了嗎？ 要驗證抗生素是否失效，可以直接用感受態(tài)涂板，作為陰性對照的。 新手做實驗?zāi)哪懿辉O(shè)計對照組的呢？你老板知道看打不打死你。 |
2樓2017-02-14 03:32:12
yudaoqian88: 回帖置頂 2017-02-14 09:54:14
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amp容易變壞，要新鮮配置，不能太多水汽。有一個amp替代物，carbenicilin 以后可以嘗試 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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4樓2017-02-14 07:44:48
yudaoqian88
至尊木蟲 (知名作家)
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送紅花一朵 |
非常感謝這位老師的幫助。 我碩士博士都在同一個研究所讀的，所以對其他實驗室了解的不多。前段時間由于實驗需要，有幸去中科院植物所一個老師那里學(xué)習(xí)實驗，看到人家的培養(yǎng)模式確實不一樣，基本上是小組性質(zhì)的，一個導(dǎo)師手下有一到兩名助理，往下就是學(xué)生，導(dǎo)師基本同學(xué)生一樣來往于實驗室，能夠給予具體的實驗指導(dǎo)。當(dāng)然，這些大牛的實驗室有豐富的科研積淀，有成熟的實驗體系，實驗路線和技術(shù)是我們這些底層實驗室所不能比擬的。 我們的情況類似于金字塔，塔尖是老板，是導(dǎo)師，依靠位置優(yōu)勢搞合作拿項目。往下面是小老師，負(fù)責(zé)課題基本科研事物，基金申請，結(jié)題等等等等。學(xué)生也是這部分人負(fù)責(zé)的。但老師們真的是忙呀，導(dǎo)師就更不用說了。在學(xué)術(shù)水平上，導(dǎo)師更多的是指導(dǎo)方向，具體的實驗導(dǎo)師們自己都搖頭的，這點無可厚非。小老師們會給學(xué)生一些指導(dǎo)，但課題的雜活是在太多，每來一個新人都忙到手足無措。所以具體實驗上的指導(dǎo)就別提了，都是學(xué)生自己摸索吧。因為老師們不用下實驗室，所以脫節(jié)了。 我們雖然在學(xué)術(shù)上沒啥成果，但導(dǎo)師本人對我們要求還是挺嚴(yán)格的，開題以及平時匯報都會盡可能邀請專家來指導(dǎo)，這點我們很感激。也聽過很多科研院所，相比之下，我們這里對學(xué)生的指導(dǎo)幫助，對學(xué)生態(tài)度等方面算是不錯的，有的地方更慘。 再次感謝老師的幫助 |
10樓2017-02-14 23:38:35
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正在學(xué)習(xí)這方面的:請問是不是還要設(shè)計個不含有AMP的培養(yǎng)基作為對照啊，還是需要設(shè)計個同時含有X-Gal�。� 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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3樓2017-02-14 05:03:39
yudaoqian88
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5樓2017-02-14 09:58:01
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6樓2017-02-14 09:59:57
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