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yudaoqian88至尊木蟲 (知名作家)
不良人
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[求助]
氨芐抗性的PUC18-3HA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101問題 已有2人參與
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又來求助了 如題，要證明轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的調(diào)控，采用pGREEN2-0800-LUC/REN雙熒光系統(tǒng)，轉(zhuǎn)錄因子是構(gòu)建到了PUC18-3HA載體上，是amp抗性的。按照操作要轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，第一次抗性弄錯了，沒長，第二次用amp，整個板子都是，和抗生素失效的感覺一樣，也查詢了一下，似乎確實(shí)有人遇到這樣的問題。 接下來要轉(zhuǎn)的話，是要提高抗生素濃度呢，還是更換農(nóng)桿菌菌株？請過來人指點(diǎn)一二，謝謝。下面是粘貼其他人的資源： 標(biāo)題: 請問有人將氨芐抗性的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌嗎？用的是哪種農(nóng)桿菌呀？ 摘要: [請問有人將氨芐抗性的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌嗎？用的是哪種農(nóng)桿菌呀？] 我把氨芐抗性的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105、GV3103中，結(jié)果12小時就都長了滿滿一板子，然后又試了下LBA4404，結(jié)果又不長。哪位大俠做過的話指導(dǎo)下我吧，我的煙草眼看就不能注射了！ 關(guān)鍵詞:[抗性 農(nóng)桿菌 表達(dá)載體 載體 菌株 實(shí)驗(yàn)室 質(zhì)粒]…… 關(guān)鍵詞: 抗性 農(nóng)桿菌 表達(dá)載體 載體 菌株 實(shí)驗(yàn)室 質(zhì)粒 我把氨芐抗性的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105、GV3103中，結(jié)果12小時就都長了滿滿一板子，然后又試了下LBA4404，結(jié)果又不長。哪位大俠做過的話指導(dǎo)下我吧，我的煙草眼看就不能注射了！ 回復(fù) 試試GV3101、EHA103看吧。不是很清楚。 回復(fù) 看質(zhì)粒有沒有整合區(qū)。沒有的話要用90RK菌株用三抗篩選。氨芐 最好換成羧卞，加利福平 慶大霉素，我記得這個菌株有兩個也不三個抗性。有點(diǎn)記不清了 這個菌株很難做，樓主再查查 。 回復(fù) 我們實(shí)驗(yàn)室也轉(zhuǎn)化過氨芐抗性的，確實(shí)板會長的沒法用，后來我們都改用卡納抗性的載體了 回復(fù) 我們實(shí)驗(yàn)室也轉(zhuǎn)化過氨芐抗性的，確實(shí)板會長的沒法用，后來我們都改用卡納抗性的載體了 不要這樣啊，這不是要重做的節(jié)奏嘛，我好不容易做好的載體  回復(fù) A4用了嗎 沒太看懂什么意思 回復(fù) 我們DH5a用的AMP,GV3101用的KANA,RIF,CARB,Mgcl2. 回復(fù) 用EHA105 將氨芐濃度提高四倍可以篩選出來。 回復(fù) 用EHA105 將氨芐濃度提高四倍可以篩選出來。 我正在做這種嘗試，希望有用呀 回復(fù) 我們DH5a用的AMP,GV3101用的KANA,RIF,CARB,Mgcl2. 謝謝你，我借個GV3101試試。 回復(fù) 謝謝你，我借個GV3101試試。... |
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西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵回帖交流 2017-02-15 07:53:51
西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵回帖交流 2017-02-15 07:53:51
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我不常上小木蟲，但是，每當(dāng)我看到有人問類似的問題，我就有點(diǎn)擔(dān)憂。 按理說，導(dǎo)師應(yīng)該是學(xué)生的指導(dǎo)人，是有一定學(xué)術(shù)水平、有過科班訓(xùn)練、發(fā)表過有一定水準(zhǔn)的SCI論文、并且能夠提供有益的指導(dǎo)、避免缺少或者無經(jīng)驗(yàn)的學(xué)生或下屬走彎路的帶頭人�？上В瑖鴥�(nèi)外，有很多導(dǎo)師并不稱職，并不配作為碩士或博士導(dǎo)師，科研已經(jīng)成為個人撈取名利的手段，全無應(yīng)有的風(fēng)度與做派。導(dǎo)致師生反目、學(xué)生厭學(xué)或抑郁的事情，常有發(fā)生。所以，學(xué)生選導(dǎo)師，不要看稱號、不要看學(xué)校，而要看導(dǎo)師本身的水準(zhǔn)與實(shí)驗(yàn)室條件以及人品。即使你是哈佛畢業(yè)的，沒有獨(dú)立一作的拿得出手的論文，你照樣沒法在科研領(lǐng)域里生存。 早些年，只要你是所謂的名校畢業(yè)的，沒有本事的混混也能拿到好待遇，現(xiàn)在是：不以出身論英雄，也算是一點(diǎn)進(jìn)步，給底層一點(diǎn)鼓勵吧。 我想說的是，從你的載體名可以看出，我猜失敗的主要的原因是：你用的是原生質(zhì)表達(dá)用的pUC載體，并不含有T-DNA區(qū)等農(nóng)桿菌載體的特點(diǎn)，故不能在農(nóng)桿菌里使用。正確的是更換effector質(zhì)粒為pCAMBIA系列的質(zhì)�；蛘遬BI121系列的質(zhì)粒。我實(shí)驗(yàn)室的學(xué)生幾年過犯過一個類似的錯誤，被我及時發(fā)現(xiàn)阻止了。 |
yudaoqian888樓2017-02-14 22:43:21
Lau_Kimura
鐵蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 41 (小學(xué)生)
- 金幣: 20.5
- 散金: 189
- 紅花: 19
- 帖子: 320
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- 性別: GG
- 專業(yè): 作物分子育種
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2017-02-14 07:45:54
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2017-02-14 07:45:54
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管它長多長少，有沒有挑菌做菌落PCR驗(yàn)證，看有沒有轉(zhuǎn)進(jìn)去。你驗(yàn)證過是不是假陽性了嗎？ 要驗(yàn)證抗生素是否失效，可以直接用感受態(tài)涂板，作為陰性對照的。 新手做實(shí)驗(yàn)?zāi)哪懿辉O(shè)計(jì)對照組的呢？你老板知道看打不打死你。 |
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2樓2017-02-14 03:32:12
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正在學(xué)習(xí)這方面的:請問是不是還要設(shè)計(jì)個不含有AMP的培養(yǎng)基作為對照啊，還是需要設(shè)計(jì)個同時含有X-Gal�。� 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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3樓2017-02-14 05:03:39
yudaoqian88: 回帖置頂 2017-02-14 09:54:14
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amp容易變壞，要新鮮配置，不能太多水汽。有一個amp替代物，carbenicilin 以后可以嘗試 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
4樓2017-02-14 07:44:48
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