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15653823606金蟲 (小有名氣)
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求助：原核表達(dá)實(shí)驗 已有1人參與
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這個蛋白根據(jù)預(yù)測是不可溶蛋白 質(zhì)粒構(gòu)建好。測序。轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）中IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。 IPTG濃度梯度 1uM/ml 0.5uM/ml 0.1uM/ml 0.05uM/ml 溫度37度 2、4、6個小時取樣 離心上樣 結(jié)果如圖所示 圖一順序 實(shí)驗 對照 實(shí)驗 對照 實(shí)驗 對照 實(shí)驗 對照 MARKER 圖二順序 實(shí)驗 對照 實(shí)驗 對照 marker 實(shí)驗 對照 實(shí)驗 對照 我覺得對照蛋白在25k 27K（兩個對照蛋白）都挺準(zhǔn)確的。應(yīng)該是實(shí)驗沒問題。 請問：1、實(shí)驗接下來，需要做些溫度梯度嗎？比如18度？28度？ 2、為什么脫色的時候，3個小時就脫色只剩marker，但是時間太短，又不能把膠脫無色。是需要增加上樣量嗎？ （我加了10ul。marker 5ul） 3、做IPTG誘導(dǎo)時候，所有不同濃度，溫度，時間都要設(shè)置對照嗎？（我目前是這樣的，感覺挺麻煩，但是實(shí)際覺得對照都一樣。） IMG_2376.JPG IMG_2377.JPG |
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15樓2017-03-09 13:23:09
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2樓2017-03-04 11:08:07
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3樓2017-03-04 11:09:31
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直接用1mM吧，預(yù)測跟實(shí)際表達(dá)情況是不太一樣的，你要看是可溶性還是包涵體就要超裂分別跑上清跟沉淀來看，確定是包涵體表達(dá)再調(diào)整溫度，一般情況下，只做37度就夠了，如果是包涵體表達(dá)，實(shí)驗條件再改變也很難做成可溶性表達(dá)。跑膠是一般要做上清跟沉淀兩個樣品，當(dāng)然還有你的未誘導(dǎo)的對照。還有，不用取不同時間點(diǎn)來做，4到6小時誘導(dǎo)完做就可以，要不然太浪費(fèi)時間跟精力，做無用功。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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156538236064樓2017-03-04 16:27:18
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