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15653823606金蟲 (小有名氣)
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求助：原核表達(dá)實(shí)驗(yàn) 已有1人參與
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這個蛋白根據(jù)預(yù)測是不可溶蛋白 質(zhì)粒構(gòu)建好。測序。轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）中IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。 IPTG濃度梯度 1uM/ml 0.5uM/ml 0.1uM/ml 0.05uM/ml 溫度37度 2、4、6個小時取樣 離心上樣 結(jié)果如圖所示 圖一順序 實(shí)驗(yàn) 對照 實(shí)驗(yàn) 對照 實(shí)驗(yàn) 對照 實(shí)驗(yàn) 對照 MARKER 圖二順序 實(shí)驗(yàn) 對照 實(shí)驗(yàn) 對照 marker 實(shí)驗(yàn) 對照 實(shí)驗(yàn) 對照 我覺得對照蛋白在25k 27K（兩個對照蛋白）都挺準(zhǔn)確的。應(yīng)該是實(shí)驗(yàn)沒問題。 請問：1、實(shí)驗(yàn)接下來，需要做些溫度梯度嗎？比如18度？28度？ 2、為什么脫色的時候，3個小時就脫色只剩marker，但是時間太短，又不能把膠脫無色。是需要增加上樣量嗎？ （我加了10ul。marker 5ul） 3、做IPTG誘導(dǎo)時候，所有不同濃度，溫度，時間都要設(shè)置對照嗎？（我目前是這樣的，感覺挺麻煩，但是實(shí)際覺得對照都一樣。） IMG_2376.JPG IMG_2377.JPG |
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直接用1mM吧，預(yù)測跟實(shí)際表達(dá)情況是不太一樣的，你要看是可溶性還是包涵體就要超裂分別跑上清跟沉淀來看，確定是包涵體表達(dá)再調(diào)整溫度，一般情況下，只做37度就夠了，如果是包涵體表達(dá)，實(shí)驗(yàn)條件再改變也很難做成可溶性表達(dá)。跑膠是一般要做上清跟沉淀兩個樣品，當(dāng)然還有你的未誘導(dǎo)的對照。還有，不用取不同時間點(diǎn)來做，4到6小時誘導(dǎo)完做就可以，要不然太浪費(fèi)時間跟精力，做無用功。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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156538236064樓2017-03-04 16:27:18
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5樓2017-03-04 17:06:35
【答案】應(yīng)助回帖
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我之前也碰到過類似的問題，對此，說一下我的經(jīng)驗(yàn)，首先確定一下你在此條件下蛋白是否可溶性表達(dá)，按照：未誘導(dǎo)菌體，誘導(dǎo)菌體，誘導(dǎo)后破碎上清，誘導(dǎo)后破碎沉淀的樣品順序，檢測一下。如果目的條帶在誘導(dǎo)后破碎沉淀中有很多而上清中非常少，基本可判斷是形成了包涵體。因此，溫度37℃可能過高，IPTG 1mM 可能也過高。IPTG濃度越高蛋雖表達(dá)的越快，但不能及時釋放到上清，可溶性受阻。所以直接先降低溫度到16℃，IPTG濃度降到0.2mM,過夜誘導(dǎo)12h左右。之后再次檢測是否可溶，如果還不行的話再換表達(dá)載體。 關(guān)于第二個問題，首先檢查一下你的染色液如果沒問題的話，適當(dāng)延長染色時間，之后脫色液隔十幾分鐘換一次，直到你覺得OK。 我們的脫色液配方：冰乙酸20ml,甲醇60ml,加水定容至200ml。染色液：考馬斯亮藍(lán)染液R250 0.25g,冰乙酸 20ml,甲醇60ml,加水定容至200ml。 關(guān)于你的第三個問題那要看你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖鞘裁戳�，如果只是要得到可溶性目的蛋白，就沒必要做那么多溫度對照。希望能夠?qū)δ阌袔椭?img src="https://muchongimg.xmcimg.com/data/emuch_bbs_images/smilies/smile.gif" align="absmiddle" border="0"> |
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8樓2017-03-06 11:46:20
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2樓2017-03-04 11:08:07
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3樓2017-03-04 11:09:31
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樓主，你表達(dá)質(zhì)粒用的是什么啊，還有，你換用rosetta表達(dá)感受態(tài)之后，誘導(dǎo)表達(dá)情況怎么樣 |
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6樓2017-03-06 09:58:42
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9樓2017-03-06 13:53:43
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10樓2017-03-06 17:09:22
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