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Lulu與璐璐新蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
求各位生物專業(yè)類大神解惑�。�！急～～ 已有2人參與
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本人生物類專業(yè)本科一枚，畢業(yè)課題中的內(nèi)容有一點(diǎn)兒疑惑：克隆得到一個(gè)基因片段，通過(guò)酶切連接的方法與L4440質(zhì)粒構(gòu)成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂板后挑取了單菌落。搖菌培養(yǎng)后，直接以基因片段的引物為引物，以菌液為模版進(jìn)行PCR，擴(kuò)出來(lái)的電泳條帶會(huì)比直接克隆得到的基因片段條帶大200bP左右嗎？ 這是正�，F(xiàn)象嗎？ 為什么會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象�。� 請(qǐng)各位生物專業(yè)類大神答疑解惑～ 十分感謝�。。� 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
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stephen.xie
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2樓2017-06-05 07:56:22
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你是怎么知道長(zhǎng)200bp左右？因?yàn)閷?duì)于比較大的片段，差200bp在電泳時(shí)不太好區(qū)別的。還有你做菌液PCR的時(shí)候，是拿之前的基因片段做陽(yáng)性對(duì)照么？然后一起跑膠？ 不用太糾結(jié)這個(gè)結(jié)果，送去測(cè)序之后就知道 到底有沒(méi)有多200bp了 祝實(shí)驗(yàn)順利 |
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3樓2017-06-05 11:21:25
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4樓2017-06-05 19:39:05
Lulu與璐璐
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5樓2017-06-05 21:33:01
Lulu與璐璐
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6樓2017-06-05 21:33:22
Lulu與璐璐
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送紅花一朵 |
菌液PCR產(chǎn)物電泳條帶顯示比之前克隆出來(lái)的目標(biāo)基因條帶 大約大了200左右～ 另外測(cè)序結(jié)果顯示是正確的，做菌液PCR的目的是為了驗(yàn)證構(gòu)建重組表達(dá)載體中是否插入了目標(biāo)基因，雖然菌液PCR電泳條帶比目標(biāo)基因條帶長(zhǎng)了，但拿去測(cè)序結(jié)果完全正確。不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，但我現(xiàn)在面臨畢業(yè)答辯，這一點(diǎn)兒不知道原因，感覺(jué)自己面臨評(píng)委老師的提問(wèn)無(wú)法解釋～ 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
7樓2017-06-05 21:40:47
傷何處
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8樓2017-06-05 22:13:18
凌緋韻
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| 樓主要看看你做pcr的酶的活性和保真性，活性特別高的酶會(huì)p出一些大一點(diǎn)的條帶，但是測(cè)序沒(méi)什么問(wèn)題。要不就看跑膠上樣的上樣loading和電泳緩沖液，跑膠中樣品鹽離子濃度低會(huì)跑出偏大或者偏小的條帶或者會(huì)有雜帶，換個(gè)高鹽離子濃度的上樣loading條帶就單一正常了。既然你有引物，可以做個(gè)菌落pcr鑒定再挑菌搖菌啊，之后提質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，最后酶切電泳圖是最準(zhǔn)的，酶切驗(yàn)證正確的送測(cè)序一般就看看有沒(méi)有點(diǎn)突變了。你的畢業(yè)答辯要是加上酶切說(shuō)服力會(huì)好一點(diǎn)，菌液PCR條帶大也不是大問(wèn)題了。 |
9樓2017-06-06 00:16:46
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