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badronger新蟲 (初入文壇)
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[求助]
利用Crispr技術(shù)敲除鏈霉菌種屬的基因 已有3人參與
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利用Crispr技術(shù)敲除鏈霉菌種屬的基因，但在第一步就花了兩個月都沒做出來，急�。。� 我是直接用的別人構(gòu)建好的質(zhì)粒，這個質(zhì)粒上原本就是20nt，我得要把這20nt置換下來，連接上我自己的20nt，我是用酶切的方式（此質(zhì)粒文獻(xiàn)中的方法），但是這個酶是BaeI酶，這個酶比較特殊而且酶切效率不是很高。目前遇到的最大問題是，我的負(fù)對照（酶切后的質(zhì)粒做連接轉(zhuǎn)化，沒有我的20nt）和我的實(shí)i驗(yàn)組長出的板子單克隆很奇怪，是那種像針尖一樣，硬的，透明的很小的單克隆，很難挑。但是也能搖出菌，可是經(jīng)測序是原始質(zhì)粒。 我目前最大困惑： （1）就是為什么負(fù)對照和實(shí)驗(yàn)組（有我自己設(shè)計(jì)的20nt）長出的單克隆形態(tài)與原始質(zhì)粒的單克隆（正常的大桿菌單克隆形態(tài)）非常不一致。 （2）雖說有可能是酶切效率不高，導(dǎo)致挑了很多單克隆都不是。但是我沒切時間有8小時，我感覺足夠長了，是不是BaeI這個酶太特別了 希望大神能幫忙一下，快三個了，沒一點(diǎn)進(jìn)展，老師逼得急啊  |
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kangaroo0513
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2樓2017-07-22 21:12:13
kangaroo0513
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4樓2017-07-24 20:14:47
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badronger
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【答案】應(yīng)助回帖
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2017-08-21 11:55:29
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2017-08-21 11:55:29
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原因可能是模板沒有去除干凈；酶連接效率太低；導(dǎo)致最后的克隆都是陰性的。 你可以： 1. 最簡單的做法，讓公司去做�，F(xiàn)在很多公司都接這種活兒。 2. 利用PCR的方法，將模板的20bp取代掉，然后dpnI酶將模板處理干凈，這樣可能效果會好些。但是也不排除還是存在假陽性。 另外，請教下關(guān)于鏈霉菌遺傳操作的事情，最近打算做相關(guān)工作，但是從沒做過�？梢曰ハ嘟涣�。 如有意，私信我你的聯(lián)系方式。 |
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