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未央mercedes新蟲 (初入文壇)
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AFLP標(biāo)記技術(shù) -云端實(shí)驗(yàn)室 已有2人參與
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實(shí)驗(yàn)概要 AFLP也是通過(guò)限制性內(nèi)切酶片段的不同長(zhǎng)度檢測(cè)DNA多態(tài)性的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)。但AFLP是通過(guò)PCR反應(yīng)先把酶切片段擴(kuò)增,然后把擴(kuò)增的酶切片段在高分辨率的順序分析膠上進(jìn)行電泳,多態(tài)性即以擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度不同被檢測(cè)出來(lái)(附圖)。實(shí)驗(yàn)中酶切片段首先與含有與其共同粘末端的人工接頭連接,連接后的粘末端順序和接頭順序就作為以后PCR反應(yīng)的引物結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中,根據(jù)需要通過(guò)選擇在末端上分別填加了1～3個(gè)選擇性核苷的不同引物,可以達(dá)到選擇性擴(kuò)增的目的。這些選擇性核苷酸使得引物能選擇性地識(shí)別具有特異配對(duì)順序的內(nèi)切酶片段,進(jìn)行結(jié)合,導(dǎo)致特異性擴(kuò)增。 主要試劑 Taq酶 EcoR I/ Mse I EcoR I/ Mse I接頭 E A引物M C引 物T4 DNA Ligase E和M引物 瓊脂 過(guò)硫酸胺 丙烯酰胺 尿素 硝酸銀 甲酰胺 dNTPs 二甲苯青 冰醋酸 玻璃硅烷 50bpMark 實(shí)驗(yàn)步驟 （一）基因組DNA提取和純化 A、參考大量提取DNA實(shí)驗(yàn)方法， B、DNA的純化：用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5µg/ml）電泳檢測(cè)片段大小，取出其中的1/3已提取的基因組DNA進(jìn)行純化,首先用TE緩沖液補(bǔ)滿至總體積50ul，再等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）、氯仿/異戊醇（24∶1）各抽提一次, 離心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/10體積的NaAC和二倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇,－20℃放置2h以上，10000g離心10min，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次 ,風(fēng)干后溶于30μlTE緩沖液中，UV-2401PC(島津)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260、A280值并定量，再用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5µg/ml）電泳檢測(cè)片段大小。 注：0.1-0.2g組織可用100ul溶液E溶，0.5g組織，溶液E可增加至300ul，此時(shí)DNA濃度大約為100ng/ul。 （二）限制性酶切及連接 在0.2ml離心管中加入：模板量約為250ng,2.5μl 10×酶切緩沖液, 2.5μl 10×T4DNA連接酶切緩沖液，5U EcoRⅠ, 5U MseⅠ,2U T4連接酶，50pmol MseⅠ接頭（序列見表2），雙蒸水補(bǔ)至25μl。用PE公司PCR擴(kuò)增儀設(shè)定37℃過(guò)夜反應(yīng)后，于65℃20min滅酶活，－20℃保存，作為預(yù)擴(kuò)增模板。 （三）預(yù)擴(kuò)增 取3μl酶切連接產(chǎn)物，加入75ng E A，75ng M C引物，15mmol/L Mg2 ，25mmol/L dNTPs，1U Tag酶，3μl 10×PCR緩沖液，加雙蒸水補(bǔ)至30μl。反應(yīng)參數(shù)為：94℃90s；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30循環(huán)；72℃10min（PE公司PCR儀）。反應(yīng)結(jié)束后，用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5µg/ml）電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，取3μl產(chǎn)物釋稀50倍，用作選擇性擴(kuò)增模板。 （四）選擇性PCR擴(kuò)增 取釋稀后的產(chǎn)物3μl，加入EcoRⅠ選擇性引物、MseⅠ選擇性引物各75ng，15mmol/L Mg2 ，25mmol/L dNTPs，1UTag酶，3μl 10×PCR緩沖液，加雙蒸水補(bǔ)至30μl。反應(yīng)參數(shù)為：94℃90s；94℃30s，65℃1min，72℃1min，13循環(huán)（每循環(huán)降0.7℃）；94℃30s， 56℃1min，72℃1min，25循環(huán)；72℃5min（PE公司PCR儀），先用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5µg/ml）電泳檢測(cè)先擇性擴(kuò)增產(chǎn)物。 （五）凝膠電泳 擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺膠(厚度0.5mm)和1×TBE電泳緩沖液電泳分離（BIO-RAD公司測(cè)序電泳儀）。拔出梳子，140W恒功率預(yù)電泳30分鐘，溫度達(dá)到47～49℃。務(wù)必使每個(gè)孔清洗出尿素。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物中加入等體積上樣緩沖液（98%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.25%二甲苯青，0.25%溴酚藍(lán)）94℃變性5min（PE公司PCR儀），結(jié)束后迅速置于冰上直到點(diǎn)樣。每個(gè)泳道加樣8μl。一開始用100W恒功率電泳約2分鐘，使樣品迅速集中到孔底部，再調(diào)到60W恒功率電泳，溫度保持在43℃左右，至二甲苯青FF至玻璃板2/3處，結(jié)束電泳。 （六）銀染 固定液：取100ml冰醋酸到900ml去離子水或雙蒸水中。染色液：1g AgNO3 ，1.5ml 37% 甲醛，加去離子水至1L。顯色液：30g Na2CO3，1.5ml 37% 甲醛，2mg硫代硫酸鈉，加去離子水至1L。 ① 電泳完畢后，將粘有凝膠的玻璃板置入用于銀染的塑料盤中。 ② 固定：加入固定液，在搖床上輕微震蕩30min。固定結(jié)束后，固定液保留。 ③ 加入去離子水漂洗3次，每次2min。 ④ 染色：將凝膠放入染色盤中，倒入染色液(4℃)，在搖床上輕微震蕩30min。用去離子水漂洗凝膠10秒鐘后，置入顯色盤中。 ⑤ 顯色：加入顯色液(4℃)，在搖床上輕微震蕩直至條帶數(shù)不再增加為止。 ⑥ 終止：加入b步驟用后的固定液，來(lái)回漂幾分鐘。達(dá)到最好效果后，用蒸餾水漂洗幾分鐘。 ⑦ 去除凝膠和玻璃板上的水珠后，放在白光燈箱上用Nikon數(shù)碼相機(jī)拍照。 （七）數(shù)據(jù)分析 用BIO-RAD公司的Quantity One 軟件統(tǒng)計(jì)，再用NTSYS軟件計(jì)算出遺傳相似性系數(shù)，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析構(gòu)建聚類圖。 反應(yīng)結(jié)束后，用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5µg/ml）電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，取3μl產(chǎn)物釋稀50倍，用作選擇性擴(kuò)增模板。 注意事項(xiàng) 1. 酶切連接作預(yù)擴(kuò)增模板時(shí)濃度需要調(diào)試，同樣預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作模板時(shí)也需要調(diào)試。 2. 酶切連接過(guò)夜，就是要充分。 3. 在染色時(shí)，時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)，需要用去離子水，不能用一般的蒸餾水。 北京庫(kù)巴扎信息科技有限公司-云端 -實(shí)驗(yàn)室 |
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Sharon敏敏2樓2013-10-10 15:34:49
Sharon敏敏
新蟲 (初入文壇)
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- 專業(yè): 植物學(xué)研究的新技術(shù)、新方
3樓2017-07-07 00:43:31
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