 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 3 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1633 | 回復(fù): 2 | |||||
未央mercedes新蟲 (初入文壇)
|
[交流]
AFLP標(biāo)記技術(shù) -云端實(shí)驗(yàn)室 已有2人參與
|
|
實(shí)驗(yàn)概要 AFLP也是通過(guò)限制性內(nèi)切酶片段的不同長(zhǎng)度檢測(cè)DNA多態(tài)性的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)。但AFLP是通過(guò)PCR反應(yīng)先把酶切片段擴(kuò)增,然后把擴(kuò)增的酶切片段在高分辨率的順序分析膠上進(jìn)行電泳,多態(tài)性即以擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度不同被檢測(cè)出來(lái)(附圖)。實(shí)驗(yàn)中酶切片段首先與含有與其共同粘末端的人工接頭連接,連接后的粘末端順序和接頭順序就作為以后PCR反應(yīng)的引物結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中,根據(jù)需要通過(guò)選擇在末端上分別填加了1～3個(gè)選擇性核苷的不同引物,可以達(dá)到選擇性擴(kuò)增的目的。這些選擇性核苷酸使得引物能選擇性地識(shí)別具有特異配對(duì)順序的內(nèi)切酶片段,進(jìn)行結(jié)合,導(dǎo)致特異性擴(kuò)增。 主要試劑 Taq酶 EcoR I/ Mse I EcoR I/ Mse I接頭 E A引物M C引 物T4 DNA Ligase E和M引物 瓊脂 過(guò)硫酸胺 丙烯酰胺 尿素 硝酸銀 甲酰胺 dNTPs 二甲苯青 冰醋酸 玻璃硅烷 50bpMark 實(shí)驗(yàn)步驟 （一）基因組DNA提取和純化 A、參考大量提取DNA實(shí)驗(yàn)方法， B、DNA的純化：用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5µg/ml）電泳檢測(cè)片段大小，取出其中的1/3已提取的基因組DNA進(jìn)行純化,首先用TE緩沖液補(bǔ)滿至總體積50ul，再等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）、氯仿/異戊醇（24∶1）各抽提一次, 離心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/10體積的NaAC和二倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇,－20℃放置2h以上，10000g離心10min，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次 ,風(fēng)干后溶于30μlTE緩沖液中，UV-2401PC(島津)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260、A280值并定量，再用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5µg/ml）電泳檢測(cè)片段大小。 注：0.1-0.2g組織可用100ul溶液E溶，0.5g組織，溶液E可增加至300ul，此時(shí)DNA濃度大約為100ng/ul。 （二）限制性酶切及連接 在0.2ml離心管中加入：模板量約為250ng,2.5μl 10×酶切緩沖液, 2.5μl 10×T4DNA連接酶切緩沖液，5U EcoRⅠ, 5U MseⅠ,2U T4連接酶，50pmol MseⅠ接頭（序列見表2），雙蒸水補(bǔ)至25μl。用PE公司PCR擴(kuò)增儀設(shè)定37℃過(guò)夜反應(yīng)后，于65℃20min滅酶活，－20℃保存，作為預(yù)擴(kuò)增模板。 （三）預(yù)擴(kuò)增 取3μl酶切連接產(chǎn)物，加入75ng E A，75ng M C引物，15mmol/L Mg2 ，25mmol/L dNTPs，1U Tag酶，3μl 10×PCR緩沖液，加雙蒸水補(bǔ)至30μl。反應(yīng)參數(shù)為：94℃90s；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30循環(huán)；72℃10min（PE公司PCR儀）。反應(yīng)結(jié)束后，用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5µg/ml）電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，取3μl產(chǎn)物釋稀50倍，用作選擇性擴(kuò)增模板。 （四）選擇性PCR擴(kuò)增 取釋稀后的產(chǎn)物3μl，加入EcoRⅠ選擇性引物、MseⅠ選擇性引物各75ng，15mmol/L Mg2 ，25mmol/L dNTPs，1UTag酶，3μl 10×PCR緩沖液，加雙蒸水補(bǔ)至30μl。反應(yīng)參數(shù)為：94℃90s；94℃30s，65℃1min，72℃1min，13循環(huán)（每循環(huán)降0.7℃）；94℃30s， 56℃1min，72℃1min，25循環(huán)；72℃5min（PE公司PCR儀），先用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5µg/ml）電泳檢測(cè)先擇性擴(kuò)增產(chǎn)物。 （五）凝膠電泳 擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺膠(厚度0.5mm)和1×TBE電泳緩沖液電泳分離（BIO-RAD公司測(cè)序電泳儀）。拔出梳子，140W恒功率預(yù)電泳30分鐘，溫度達(dá)到47～49℃。務(wù)必使每個(gè)孔清洗出尿素。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物中加入等體積上樣緩沖液（98%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.25%二甲苯青，0.25%溴酚藍(lán)）94℃變性5min（PE公司PCR儀），結(jié)束后迅速置于冰上直到點(diǎn)樣。每個(gè)泳道加樣8μl。一開始用100W恒功率電泳約2分鐘，使樣品迅速集中到孔底部，再調(diào)到60W恒功率電泳，溫度保持在43℃左右，至二甲苯青FF至玻璃板2/3處，結(jié)束電泳。 （六）銀染 固定液：取100ml冰醋酸到900ml去離子水或雙蒸水中。染色液：1g AgNO3 ，1.5ml 37% 甲醛，加去離子水至1L。顯色液：30g Na2CO3，1.5ml 37% 甲醛，2mg硫代硫酸鈉，加去離子水至1L。 ① 電泳完畢后，將粘有凝膠的玻璃板置入用于銀染的塑料盤中。 ② 固定：加入固定液，在搖床上輕微震蕩30min。固定結(jié)束后，固定液保留。 ③ 加入去離子水漂洗3次，每次2min。 ④ 染色：將凝膠放入染色盤中，倒入染色液(4℃)，在搖床上輕微震蕩30min。用去離子水漂洗凝膠10秒鐘后，置入顯色盤中。 ⑤ 顯色：加入顯色液(4℃)，在搖床上輕微震蕩直至條帶數(shù)不再增加為止。 ⑥ 終止：加入b步驟用后的固定液，來(lái)回漂幾分鐘。達(dá)到最好效果后，用蒸餾水漂洗幾分鐘。 ⑦ 去除凝膠和玻璃板上的水珠后，放在白光燈箱上用Nikon數(shù)碼相機(jī)拍照。 （七）數(shù)據(jù)分析 用BIO-RAD公司的Quantity One 軟件統(tǒng)計(jì)，再用NTSYS軟件計(jì)算出遺傳相似性系數(shù)，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析構(gòu)建聚類圖。 反應(yīng)結(jié)束后，用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5µg/ml）電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，取3μl產(chǎn)物釋稀50倍，用作選擇性擴(kuò)增模板。 注意事項(xiàng) 1. 酶切連接作預(yù)擴(kuò)增模板時(shí)濃度需要調(diào)試，同樣預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作模板時(shí)也需要調(diào)試。 2. 酶切連接過(guò)夜，就是要充分。 3. 在染色時(shí)，時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)，需要用去離子水，不能用一般的蒸餾水。 北京庫(kù)巴扎信息科技有限公司-云端 -實(shí)驗(yàn)室 |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 分子技術(shù)專輯 | 叮叮當(dāng)當(dāng)淘貼集 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有183人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
Sharon敏敏2樓2013-10-10 15:34:49
Sharon敏敏
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 48.9
- 散金: 50
- 帖子: 36
- 在線: 8.4小時(shí)
- 蟲號(hào): 5042567
- 注冊(cè): 2016-09-21
- 性別: MM
- 專業(yè): 植物學(xué)研究的新技術(shù)、新方
3樓2017-07-07 00:43:31
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 未央mercedes 的主題更新
| 3 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 286分人工智能專業(yè)請(qǐng)求調(diào)劑愿意跨考！ +3 | lemonzzn 2026-03-17 | 3/150 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[論文投稿]
申請(qǐng)回稿延期一個(gè)月，編輯同意了。但系統(tǒng)上的時(shí)間沒變，給編輯又寫郵件了，沒回復(fù)
 10+3
|
wangf9518 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0856調(diào)劑，是學(xué)校就去 +6 | sllhht 2026-03-19 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 288求調(diào)劑，一志愿華南理工大學(xué)071005 +5 | ioodiiij 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研]
 271材料工程求調(diào)劑
+6
|
.6lL 2026-03-18 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿北京化工大學(xué)0703化學(xué)318分，有科研經(jīng)歷，求調(diào)劑 +3 | 一瓶苯甲酸 2026-03-14 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 317求調(diào)劑 +3 | 申子申申 2026-03-19 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | Mqqqqqq 2026-03-19 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 332求調(diào)劑 +3 | ydfyh 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 本科鄭州大學(xué)物理學(xué)院，一志愿華科070200學(xué)碩，346求調(diào)劑 +4 | 我不是一根蔥 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué) 305求調(diào)劑 +4 | FY_yy 2026-03-14 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 344求調(diào)劑 +6 | knight344 2026-03-16 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿武理材料305分求調(diào)劑 +5 | 想上岸的鯉魚 2026-03-18 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 280求調(diào)劑 +6 | 咕嚕曉曉 2026-03-18 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料，紡織，生物（0856、0710），化學(xué)招生啦 +3 | Eember. 2026-03-17 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 一志愿南京大學(xué)，080500材料科學(xué)與工程，調(diào)劑 +4 | Jy? 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑 +3 | 聽風(fēng)就是雨； 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 274求調(diào)劑 +5 | 時(shí)間點(diǎn) 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0854控制工程 359求調(diào)劑 可跨專業(yè) +3 | 626776879 2026-03-14 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 0703 物理化學(xué)調(diào)劑 +3 | 我可以上岸的對(duì)?/a> 2026-03-13 | 5/250 |
|