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林小露銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
設(shè)計(jì)引物遇到難題 已有3人參與
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本人擴(kuò)增的序列為946bp，21-608為CDS，以下為基因序列； 1 agaagaaccc gacaccagaa atggagaaga aattgtttgg tatcgcttta ctcttaacta 61 ctgtagcctc agttttggcc gccgatacaa acgccccaat atgtctttgt gacgagccag 121 gagttctagg acggactcag atcgtgacga cggagattaa agataagatc gagaaagctg 181 tcgaagctgt tgcacaagag agtggtgtat caggaagagg attttctata ttttctcatc 241 atcctgtgtt cagggaatgt ggcaaatacg agtgtcgaac cgtgaggcct gaacacagcc 301 gttgctataa ctttcccccg tttattcatt tcaagtcaga atgccctgtt tcaactcgag 361 actgtgagcc agtatttggt tatacggtag caggagagtt tagggttatt gtacaggctc 421 caagggctgg gtttagacag tgtgtgtggc aacataagtg tcgattcggt agtaacagct 481 gtggttataa tgggaggtgt actcagcaga ggtcagtggt tcgtttggtg acctacaact 541 tggagaaaga cggtttcttg tgtgaaagct tccgaacatg ctgtggttgt ccttgtcgta 601 gtttttaagc ctaactcatg ggttttagtt cttaagtcta actcattaag actaaattgt 661 taagccaaac tcatgagttt agacacaagg attattcagt actatctttg caaatattac 721 tttttgattg ttagtttcga caaattaacg atgcttgttc aaattttaaa accttctaaa 781 ctacagaact aacattcagt aaaatataat ttgatttcgt aattacaata agaacgtaac 841 atgtattgtt atcaccttct ccatccaatc attttttata ctctgtatga ataaaatact 901 gtatggaatg tactttgtac aataaagtta aatatatatc tatgcc 用pp5設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)條件上游引物在1-20bp內(nèi)，下游引物在609-946bp內(nèi)。引物長(zhǎng)度在18-21內(nèi)均試過(guò)，得到的上下游引物Tm值相差非常大，上下游引物的GC含量相差也很大，條件很不好，不懂的應(yīng)該怎么改條件，按照網(wǎng)上的說(shuō)法改了條件還是不好，求大神賜教�。。� |
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didongwei
金蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 49 (小學(xué)生)
- 金幣: 6350.7
- 散金: 25
- 紅花: 14
- 帖子: 1048
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- 蟲(chóng)號(hào): 1909384
- 注冊(cè): 2012-07-25
- 性別: GG
- 專業(yè): 植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
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這個(gè)要試，一般先以低的那個(gè)作參考，在其基礎(chǔ)上降低1到2度，然后擴(kuò)增，如果沒(méi)有雜帶就可以，如果有雜帶就逐漸提高溫度，直至沒(méi)有雜帶為止，如果溫度調(diào)到擴(kuò)增不出來(lái)，也還是沒(méi)有合適溫度就更換引物，主要是換酶切位點(diǎn)，或者保護(hù)堿基換成G或C 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
28樓2017-10-14 22:55:32
2樓2017-10-12 17:26:21
林小露
銅蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1157.6
- 帖子: 118
- 在線: 16.8小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 5239513
- 注冊(cè): 2016-11-15
- 性別: MM
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
3樓2017-10-12 20:04:20
4樓2017-10-12 20:49:15
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