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林小露主管區(qū)長
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[求助]
設(shè)計引物遇到難題 已有3人參與
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本人擴增的序列為946bp，21-608為CDS，以下為基因序列； 1 agaagaaccc gacaccagaa atggagaaga aattgtttgg tatcgcttta ctcttaacta 61 ctgtagcctc agttttggcc gccgatacaa acgccccaat atgtctttgt gacgagccag 121 gagttctagg acggactcag atcgtgacga cggagattaa agataagatc gagaaagctg 181 tcgaagctgt tgcacaagag agtggtgtat caggaagagg attttctata ttttctcatc 241 atcctgtgtt cagggaatgt ggcaaatacg agtgtcgaac cgtgaggcct gaacacagcc 301 gttgctataa ctttcccccg tttattcatt tcaagtcaga atgccctgtt tcaactcgag 361 actgtgagcc agtatttggt tatacggtag caggagagtt tagggttatt gtacaggctc 421 caagggctgg gtttagacag tgtgtgtggc aacataagtg tcgattcggt agtaacagct 481 gtggttataa tgggaggtgt actcagcaga ggtcagtggt tcgtttggtg acctacaact 541 tggagaaaga cggtttcttg tgtgaaagct tccgaacatg ctgtggttgt ccttgtcgta 601 gtttttaagc ctaactcatg ggttttagtt cttaagtcta actcattaag actaaattgt 661 taagccaaac tcatgagttt agacacaagg attattcagt actatctttg caaatattac 721 tttttgattg ttagtttcga caaattaacg atgcttgttc aaattttaaa accttctaaa 781 ctacagaact aacattcagt aaaatataat ttgatttcgt aattacaata agaacgtaac 841 atgtattgtt atcaccttct ccatccaatc attttttata ctctgtatga ataaaatact 901 gtatggaatg tactttgtac aataaagtta aatatatatc tatgcc 用pp5設(shè)計引物，設(shè)計條件上游引物在1-20bp內(nèi)，下游引物在609-946bp內(nèi)。引物長度在18-21內(nèi)均試過，得到的上下游引物Tm值相差非常大，上下游引物的GC含量相差也很大，條件很不好，不懂的應(yīng)該怎么改條件，按照網(wǎng)上的說法改了條件還是不好，求大神賜教�。。� |
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擴基因全長，分兩種情況，如果是從質(zhì)粒中擴，引物直接取起始密碼子和終止密碼子，如果從cDNA中擴，那就必須在utr區(qū)設(shè)計引物， 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
29樓2017-10-15 15:09:56
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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隨便幫你選了一段序列，具體可以參照NCBI上的在線軟件 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/too ... enH61LOZlpB7Ldr8Dyg 大.png |
14樓2017-10-13 12:03:53
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17樓2017-10-13 19:01:42
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如果用酶切法做，還要加酶切位點和保護(hù)堿基，設(shè)計好后單條引物長度不要大于35bp就行，設(shè)計這種載體引物不用考慮那么多，設(shè)計出來試就可以了。另外載體引物一般不會像你說的在兩側(cè)設(shè)計…… 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
23樓2017-10-13 22:25:25
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這個要試，一般先以低的那個作參考，在其基礎(chǔ)上降低1到2度，然后擴增，如果沒有雜帶就可以，如果有雜帶就逐漸提高溫度，直至沒有雜帶為止，如果溫度調(diào)到擴增不出來，也還是沒有合適溫度就更換引物，主要是換酶切位點，或者保護(hù)堿基換成G或C 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
28樓2017-10-14 22:55:32
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