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yonghui0539金蟲 (初入文壇)
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[求助]
gateway -LR反應(yīng)，請知道的幫忙 已有1人參與
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新手在此請教。 我用gateway，LR反應(yīng)總是不成功，涂板子不長。找不到原因，在此發(fā)帖尋求幫助，多些人多些建議，先謝謝各位。 下面是我做得過程： 1. 首先拿到entry clone（這個是一個博后做的，走了）好像是合成的目的片段，然后送到公司他們做得BP反應(yīng)。我拿到的還有光盤，里面都是PDF文件關(guān)于這個entry clone的，所以我覺得應(yīng)該是沒有問題的。我就直接擴增了entry clone，提取了質(zhì)粒，酶切檢測也是對的，我沒有測序。 2. 我在實驗室管理員那里找到了destination vector，然后也擴增了，挺好的，沒有問題，然后提質(zhì)粒，然后我用酶切檢測質(zhì)粒也是對的（實驗室之前都是用這個載體，應(yīng)該也不會有問題） entry clone 和目的載體都有了，我就直接LR反應(yīng)了，然后問題也來了。 entry clone（100ng） 1ul destination（100ng） 2ul 酶 1ul TE 1ul 或者 entry clone（30ng） 3ul destination（120ng） 1ul 酶 1ul 反應(yīng)過夜也沒有長菌落，然后我就又調(diào)整體系和濃度，也不行。我看有些說明說需要線性化載體，我也酶切了，還是沒有成功，做了2個星期。我覺得平板和抗生素都應(yīng)該沒有問題，LR反應(yīng)的酶也應(yīng)該沒有問題，我做個陽性對照，成功了，雖然長得克隆少點。但是在12h長，最起碼長了。 要是有比較好的建議請告訴我，謝謝 |
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