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yonghui0539金蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
gateway -LR反應(yīng)，請(qǐng)知道的幫忙 已有1人參與
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新手在此請(qǐng)教。 我用gateway，LR反應(yīng)總是不成功，涂板子不長(zhǎng)。找不到原因，在此發(fā)帖尋求幫助，多些人多些建議，先謝謝各位。 下面是我做得過(guò)程： 1. 首先拿到entry clone（這個(gè)是一個(gè)博后做的，走了）好像是合成的目的片段，然后送到公司他們做得BP反應(yīng)。我拿到的還有光盤(pán)，里面都是PDF文件關(guān)于這個(gè)entry clone的，所以我覺(jué)得應(yīng)該是沒(méi)有問(wèn)題的。我就直接擴(kuò)增了entry clone，提取了質(zhì)粒，酶切檢測(cè)也是對(duì)的，我沒(méi)有測(cè)序。 2. 我在實(shí)驗(yàn)室管理員那里找到了destination vector，然后也擴(kuò)增了，挺好的，沒(méi)有問(wèn)題，然后提質(zhì)粒，然后我用酶切檢測(cè)質(zhì)粒也是對(duì)的（實(shí)驗(yàn)室之前都是用這個(gè)載體，應(yīng)該也不會(huì)有問(wèn)題） entry clone 和目的載體都有了，我就直接LR反應(yīng)了，然后問(wèn)題也來(lái)了。 entry clone（100ng） 1ul destination（100ng） 2ul 酶 1ul TE 1ul 或者 entry clone（30ng） 3ul destination（120ng） 1ul 酶 1ul 反應(yīng)過(guò)夜也沒(méi)有長(zhǎng)菌落，然后我就又調(diào)整體系和濃度，也不行。我看有些說(shuō)明說(shuō)需要線(xiàn)性化載體，我也酶切了，還是沒(méi)有成功，做了2個(gè)星期。我覺(jué)得平板和抗生素都應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題，LR反應(yīng)的酶也應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題，我做個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，成功了，雖然長(zhǎng)得克隆少點(diǎn)。但是在12h長(zhǎng)，最起碼長(zhǎng)了。 要是有比較好的建議請(qǐng)告訴我，謝謝 |
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entry載體上一般有一個(gè)pva酶切位點(diǎn)，說(shuō)明書(shū)上有，是抗性基因上的。你用的時(shí)候確認(rèn)一下。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
8樓2017-08-22 23:00:22
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9樓2017-08-22 23:01:04
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