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dearestff金蟲 (小有名氣)
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三種木質(zhì)素降解酶酶活測定方法探討 已有6人參與
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小弟正準(zhǔn)備做木質(zhì)素降解酶活測定，以前沒接觸過，看到文獻中和論壇中測LiP、MnP和Lac酶活的方法很多而且不一，即使是用同一種底物，各溶液濃度和加入量也不統(tǒng)一，吸光度換算酶活公式等，很沒頭緒啊，希望能有一種統(tǒng)一可靠的三種酶活菜鳥級詳細(xì)測定方法，歡迎各位蟲友踴躍發(fā)言！小弟家底寒磣就不上金幣了~在此奉上自己找的測定方法，請各位大神指導(dǎo)改正！ LiP： A：反應(yīng)混合物 (4mL)含 2mmol L- 1藜蘆醇、0.4 mmo l L- 1過氧化氫和50 mmol L- 1酒石酸-酒石酸鈉緩沖溶液(pH =2.5)以及1mL粗酶液,用紫外分光光度計檢測310nm處30 s/2.5min內(nèi)吸光度值的變化. 定義每分鐘氧化 1μmo l藜蘆醇成藜蘆醛所需的酶量為 1個酶活力單位。 B：取 0.2mL 藜蘆醇溶液（10mmol•L-1）、0.4mL 酒石酸緩沖液（250mmol•L-1，pH=3.0）與 0.4mL 粗酶液混勻，即得 1mL 反應(yīng)液。在 30℃下，于反應(yīng)液中加 20μLH2O2溶液（20mmol•L-1）啟動酶促反應(yīng)，以未加啟動因子的反應(yīng)液為參比，用紫外分光光度計（UV-2550）測定 310nm 處 2min 前后反應(yīng)液吸光度的變化。一個酶活力單位（U）定義為每分鐘氧化藜蘆醇產(chǎn)生 1μmol藜蘆醛所需的酶量 MnP： 反應(yīng)混合物( 4 mL)含0.1 mmol L- 1硫酸錳、0 . 1 mmol L- 1過氧化氫和100 mmol L- 1酒石酸-酒石酸鈉緩沖溶液 ( p H =5.0)以及 1mL粗酶液,用紫外分光光度計檢測238nm處 10 s內(nèi)吸光度值的變化。定義每分鐘氧化 1μmol Mn2+為 Mn3+所需的酶量為 1個酶活力單位。 Lac： ABTS－分光光度計法：采用醋酸鈉溶液作為緩沖溶液,在反應(yīng)體系內(nèi)的終濃度常為 0.02、0.05或0.10 mol /L , pH主要在4 ~ 5之間。反應(yīng)體系內(nèi)ABTS的濃度在 0.1 ~ 5 mmo l/L , 常用終濃度為0.5 mmo l/L。測定反應(yīng)一般在室溫下進行，ABTS經(jīng)漆酶作用后形成ABTS自由基,在420 nm處ABTS自由基的吸光系數(shù)遠(yuǎn)大于底物ABTS, 隨著ABTS自由基濃度的增加, 吸光度值變大,因此一般在420 nm處檢測OD值的變化。 愈創(chuàng)木酚法：10 mL反應(yīng)體系中, 含 50 mmol L- 1琥珀酸鈉緩沖溶液(pH 值4. 5) , 0. 4 mmol L- 1的愈創(chuàng)木酚和0. 5 mL的酶液, 30℃條件下反應(yīng)30 min 后, 于465 nm 處測OD 值.酶活力定義為: 以滅活的酶液反應(yīng)混合物做對照, 1 min 內(nèi)催化氧化1 nmoL 愈創(chuàng)木酚的酶量為1 U。 |
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