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uulove37金蟲 (著名寫手)
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[求助]
微生物降解纖維素的纖維素酶活如何測(cè)？
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| 求助：纖維素降解過(guò)程中的的纖維素酶活怎么測(cè)��？最好有具體的步驟，各種藥品的用量也都越清楚越好！謝謝 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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uulove37(金幣+5): 2011-06-30 20:39:06
wolfebst(金幣+5, EPI+1): 鼓勵(lì) 2011-06-30 22:00:53
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我當(dāng)時(shí)的測(cè)定方法 主要試劑配制方法 1．硝基水楊酸（DNS）試劑[91]: 稱取酒石酸鉀鈉91g，溶于500ml蒸餾水中，加熱至50℃溶解，再依次加入3，5-二硝基水楊酸(DNS)3.5g，NaOH20g，苯酚2.5g，無(wú)水亞硫酸鈉2.5g，攪拌至完全溶解。冷卻后用蒸餾水定容至1000ml，儲(chǔ)于棕色瓶中4℃保存，放置1周左右后使用，使用前過(guò)濾。 2．1mg/lml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：精確稱取105℃烘至恒重的無(wú)水葡萄糖(分析純)1.000g，用蒸餾水溶解后，定容至1000ml容量瓶中備用。 3．1%CMC底物溶液：1克CMC加熱溶化于100m1pH值4.8，0.lmol/L的檸檬酸一檬酸鈉緩沖液中。 4．pH值4.8，0.lmol/L的檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖液: 0.lmol/L檸檬酸：含檸檬酸•H2O21.01g/L。 0.lmol/L的檸檬酸三鈉：含檸檬酸三鈉•2H2O 29.4g/L。 0.lmol/L的檸檬酸40ml與0.lmol/L的檸檬酸三鈉60.6ml混合即可。 5. KH2PO4-Na2HPO緩沖液（pH7.0） 取 4.539 克 KH2PO4 和 11.939 克 Na2HPO4•12H2O，溶解于蒸餾水中，定容至1000mL，用 0.5mol/L KH2PO4 或 0.5mol/L Na2HPO4 調(diào)至 pH7.0。 3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定還原糖 測(cè)定原理 纖維素經(jīng)纖維素酶水解后生成還原糖，還原糖能將3，5—二硝基水楊酸（DNS）中硝基還原成氨基，溶液變?yōu)槌壬陌被衔铮?3—氨基—5—二硝基水楊酸)，在一定的還原糖濃度范圍內(nèi)，橙色的深度與還原糖的濃度成正比，從而可推算出溶液中還原糖的含量。 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取七只25ml的比色管，分別編號(hào)，然后按下表加入試劑后，540nm測(cè)定吸光值，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 Table2-3 Glucose standard curve drawing 項(xiàng)目 管號(hào) 0 1 2 3 4 5 6 葡萄糖標(biāo)樣（ml） 0 1.5 2 2.5 3 3.25 3.5 含糖總量（mg） 0 1.5 2 2.5 3 3.25 3.5 DNS（ml） 3 3 3 3 3 3 3 加水至10ml刻度線 沸水煮沸10min，使其充分反應(yīng)后，流水快速冷卻 定容 25 25 25 25 25 25 25 纖維素酶酶活測(cè)定 1 濾紙酶活測(cè)定 以濾紙為底物，在一定反應(yīng)條件(pH4.8，50℃，恒溫lh)下，以水解反應(yīng)中l(wèi)ml纖維素酶液lmin催化纖維素生成lµg葡萄糖為1個(gè)濾紙酶活單位，以U表示，該酶活力代表了纖維素酶的三種酶組分協(xié)同作用后的總酶活。測(cè)定方法為：取1ml適當(dāng)稀釋的酶液，加入pH值為4.8，0.lmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液2ml，再加入50土0.5mg濾紙(1cmx6cm)一條，于50℃保溫酶解反應(yīng)1小時(shí) (先預(yù)熱5分鐘)，然后加入DNS顯色液3ml，放入已沸騰的水中沸水浴10min，流水冷卻后在540nm下測(cè)吸光度。同時(shí)用100℃煮沸10min后失活的酶液作為空白對(duì)照。根據(jù)吸光度從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的葡萄糖含量，根據(jù)生成的葡萄糖克數(shù)計(jì)算出酶活值。濾紙酶活按下面公式計(jì)算:：X=(WxNxMx1000)/T X：濾紙酶酶活力，單位U/ml；W：從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的葡萄糖的濃度(mg/ml)。 M：反應(yīng)后樣品總體積(ml)；N：酶液稀釋倍數(shù)；T:反應(yīng)時(shí)間(min)。 2 CMC酶活測(cè)定 以1%CMC溶液為底物，在一定反應(yīng)條件(pH4.8，50℃，恒溫30min)下，以水解反應(yīng)中，lml纖素酶液lmin催化纖維素生成lµg葡萄糖為1個(gè)CMC酶活單位，以U表示。該酶活代表了纖維素酶內(nèi)切葡聚糖酶活力。測(cè)定方法為：取1ml適當(dāng)稀釋的酶液，加入1%CMC底物溶液2ml，50℃保溫酶解反應(yīng)30min(先預(yù)熱5分鐘然)后加入DNS顯色液3ml，放入已沸騰的水中沸水浴10min，流水冷卻后在540nm下測(cè)吸光度。同時(shí)用100℃煮沸10min后失活的酶作為空白對(duì)照。根據(jù)吸光度從葡萄糖標(biāo)曲線中查出相應(yīng)的葡萄糖含量，根據(jù)生成的葡萄糖克數(shù)計(jì)算出CMC酶活值。 |
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siwonyy
2樓2011-06-30 09:39:24
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【答案】應(yīng)助回帖
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uulove37(金幣+5): 2011-06-30 20:45:57
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wolfebst(金幣+3): 鼓勵(lì) 2011-06-30 22:01:23
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篩選用剛果紅，測(cè)酶活用DNS法。 具體方法參見(jiàn)： http://wenku.baidu.com/view/6fb4b852ad02de80d5d84005.html 話說(shuō)纖維素酶是我本科時(shí)某幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室做的課題，lz是哪個(gè)學(xué)校的啊 |
3樓2011-06-30 11:10:01
uulove37
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