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CD47是一種在腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的膜蛋白，其能與巨噬細(xì)胞表面的CD47的受體--信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α（Signal Regulatory Protein α，SIRP α）結(jié)合，釋放“不吃我”信號(hào)，抑制巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。有研究表明，活化的T淋巴細(xì)胞中膜蛋白CD47高表達(dá)，其通過與血小板反應(yīng)蛋白1（Thrombospondin-1，TSP1）結(jié)合，抑制T淋巴細(xì)胞的增殖與活化，進(jìn)而影響T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。因此，封閉細(xì)胞表面的CD47將有助于維持巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬以及T淋巴細(xì)胞的增殖與活化。 在本課題中，我們將來自于SIRPα突變株CV1、具有高親和力結(jié)合CD47的作用的肽段和人類IgG1的Fc段三段基因融合，命名為SF基因，將SF融合基因嵌入到35型非增殖型腺病毒的基因組中。利用構(gòu)建的腺病毒Ad35-SF感染T淋巴細(xì)胞，表達(dá)并分泌SF蛋白從而封閉細(xì)胞表面的CD47，探尋當(dāng)T細(xì)胞膜蛋白CD47被封閉之后，T細(xì)胞功能的一些變化。本實(shí)驗(yàn)選用Jurkat細(xì)胞作為研究對(duì)象，探索被封閉CD47的Jurkat細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞殺傷效率影響，病毒Ad35-SF感染CTL或是CIK細(xì)胞后，T細(xì)胞活性的改變。主要方法及結(jié)果如下： （1）篩選在T細(xì)胞中高效啟動(dòng)的啟動(dòng)子以及探索35型與5型腺病毒對(duì)T細(xì)胞的感染效率的高低 通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測方法檢測篩選出啟動(dòng)子TCEF1α（in）在Jurkat T細(xì)胞中啟動(dòng)活性最高；通過免疫熒光技術(shù)以及流式細(xì)胞術(shù)檢測不同纖毛類型的腺病毒對(duì)T細(xì)胞的感染效率得出，35型腺病毒感染Jurkat T細(xì)胞的能力優(yōu)于5型腺病毒。 （2）重組腺病毒載體Ad35-SF的構(gòu)建、鑒定及在HEK293細(xì)胞中的檢測融合基因SF的表達(dá) 利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了Ad35-SF，通過PCR對(duì)其進(jìn)行鑒定，挑選包含目的基因并且?guī)缀醪缓幸吧拖俨《镜目寺�；通過Western Blot以及ELISA檢測發(fā)現(xiàn)Ad35-SF能夠有效的感染HEK293細(xì)胞并表達(dá)SF蛋白。 （3）檢測病毒Ad35-SF對(duì)Jurkat細(xì)胞以及CIK細(xì)胞功能的影響 Western Blot結(jié)果表明：Ad35-SF能夠感染Jurkat以及CIK細(xì)胞并分泌SF蛋白。ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ad35-SF感染Jurkat細(xì)胞48小時(shí)后上清中SF的表達(dá)量可到達(dá)19.1 μg/ml；通過流式檢測，通過重組腺病毒Ad35-SF表達(dá)的融合蛋白對(duì)CIK細(xì)胞以及Jurkat細(xì)胞表面CD47均有良好的封閉效果。Ad35-SF（MOI=1）感染Jurkat細(xì)胞18小時(shí)后，細(xì)胞CD47陽性比例從97.06％下降到15.32％；當(dāng)Ad35-SF感染復(fù)數(shù)增加至5,10時(shí)，CD47陽性比率分別將至2.94%和1.73%。 （4）封閉CD47后對(duì)Jurkat細(xì)胞的功能影響 通過CCK8方法檢測Jurkat細(xì)胞的增殖以及對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，結(jié)果表明：相較于空病毒對(duì)照組，Ad35-SF感染Jurkat細(xì)胞后，48 h后Jurkat細(xì)胞增殖效果提高了29％，同時(shí)要高于沒有病毒感染組。感染Ad35-SF的Jurkat的細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞株Hep 3B的殺傷作用提升25.6％（p<0.01）。 以上結(jié)果表明構(gòu)建的重組腺病毒Ad35-SF能有效感染Jurkat細(xì)胞并在其內(nèi)表達(dá)分泌融合蛋白SF，封閉Jurkat細(xì)胞表面的CD47分子能夠有效的提高Jurkat細(xì)胞的增殖能力和對(duì)肝癌細(xì)胞Hep 3B的殺傷作用。 求畢業(yè)�。「魑淮蟾绱蠼阆戎x過！ [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
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5樓2015-02-05 15:38:06
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