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CD47是一種在腫瘤細胞表面高表達的膜蛋白，其能與巨噬細胞表面的CD47的受體--信號調(diào)節(jié)蛋白α（Signal Regulatory Protein α，SIRP α）結(jié)合，釋放“不吃我”信號，抑制巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用，導(dǎo)致腫瘤細胞免疫逃逸。有研究表明，活化的T淋巴細胞中膜蛋白CD47高表達，其通過與血小板反應(yīng)蛋白1（Thrombospondin-1，TSP1）結(jié)合，抑制T淋巴細胞的增殖與活化，進而影響T淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。因此，封閉細胞表面的CD47將有助于維持巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬以及T淋巴細胞的增殖與活化。 在本課題中，我們將來自于SIRPα突變株CV1、具有高親和力結(jié)合CD47的作用的肽段和人類IgG1的Fc段三段基因融合，命名為SF基因，將SF融合基因嵌入到35型非增殖型腺病毒的基因組中。利用構(gòu)建的腺病毒Ad35-SF感染T淋巴細胞，表達并分泌SF蛋白從而封閉細胞表面的CD47，探尋當(dāng)T細胞膜蛋白CD47被封閉之后，T細胞功能的一些變化。本實驗選用Jurkat細胞作為研究對象，探索被封閉CD47的Jurkat細胞對肝癌細胞殺傷效率影響，病毒Ad35-SF感染CTL或是CIK細胞后，T細胞活性的改變。主要方法及結(jié)果如下： （1）篩選在T細胞中高效啟動的啟動子以及探索35型與5型腺病毒對T細胞的感染效率的高低 通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測方法檢測篩選出啟動子TCEF1α（in）在Jurkat T細胞中啟動活性最高；通過免疫熒光技術(shù)以及流式細胞術(shù)檢測不同纖毛類型的腺病毒對T細胞的感染效率得出，35型腺病毒感染Jurkat T細胞的能力優(yōu)于5型腺病毒。 （2）重組腺病毒載體Ad35-SF的構(gòu)建、鑒定及在HEK293細胞中的檢測融合基因SF的表達 利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了Ad35-SF，通過PCR對其進行鑒定，挑選包含目的基因并且?guī)缀醪缓幸吧拖俨《镜目寺�；通過Western Blot以及ELISA檢測發(fā)現(xiàn)Ad35-SF能夠有效的感染HEK293細胞并表達SF蛋白。 （3）檢測病毒Ad35-SF對Jurkat細胞以及CIK細胞功能的影響 Western Blot結(jié)果表明：Ad35-SF能夠感染Jurkat以及CIK細胞并分泌SF蛋白。ELISA實驗證實Ad35-SF感染Jurkat細胞48小時后上清中SF的表達量可到達19.1 μg/ml；通過流式檢測，通過重組腺病毒Ad35-SF表達的融合蛋白對CIK細胞以及Jurkat細胞表面CD47均有良好的封閉效果。Ad35-SF（MOI=1）感染Jurkat細胞18小時后，細胞CD47陽性比例從97.06％下降到15.32％；當(dāng)Ad35-SF感染復(fù)數(shù)增加至5,10時，CD47陽性比率分別將至2.94%和1.73%。 （4）封閉CD47后對Jurkat細胞的功能影響 通過CCK8方法檢測Jurkat細胞的增殖以及對腫瘤細胞的殺傷作用，結(jié)果表明：相較于空病毒對照組，Ad35-SF感染Jurkat細胞后，48 h后Jurkat細胞增殖效果提高了29％，同時要高于沒有病毒感染組。感染Ad35-SF的Jurkat的細胞對肝癌細胞株Hep 3B的殺傷作用提升25.6％（p<0.01）。 以上結(jié)果表明構(gòu)建的重組腺病毒Ad35-SF能有效感染Jurkat細胞并在其內(nèi)表達分泌融合蛋白SF，封閉Jurkat細胞表面的CD47分子能夠有效的提高Jurkat細胞的增殖能力和對肝癌細胞Hep 3B的殺傷作用。 求畢業(yè)啊！各位大哥大姐先謝過！ [ 發(fā)自手機版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
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