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求助大神，分子基礎(chǔ)薄弱 引物設(shè)計(jì)擴(kuò)不出來(lái)!
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我的目的基因序列TTGGACAACGCCTTCCCCTTCGGGACATGCATCAACACGTCCGTCATCCAGAAGCCGGCCTTCCTCGACTTCTTCACCAACCACTTCGACTGGGCCGTCTTCGAGAACGAGCTCAAGTGGTACCACACGGAGGTGCAGCAGGGCCAGCTCAACTACGCCGACGCCGACGCGCTGCTCGCGTTCTGCGACCGCCTGGGCAAGACCGTCCGCGGCCACTGCGTCTTCTGGTCCGTGGACGGCGACGTGCAGCAGTGGGTCAAGAACCTCAACAAGGACCAGCTCAGGTCCGCCATGCAGAGCCGCCTCGAGGGCCTCGTCTCCCGCTACGCCGGCAGGTTCAAGCACTACGACGTCAACAACGAGATGCTGCACGGCCGCTTCTTCCGGGACCGCCTCGGCGACGAGGACGTCCCGGCGTACATGTTCAAGGAGGTGGCGCGGCTGGACCCGGAGCCCGTGCTCTTCGTCAACGACTACAACGTGGAGTGCGGCAACGACCCCAACGCGACGCCGGAGAAGTACGCCGAGCAGGTCGCATGGCTGCAGAGCTGCGGCGCGGTGGTGCGCGGCATCGGGCTGCAGGGCCACGTGCAAAACCCGGTCGGGGAGGTCATCTGCGCCGCGCTCGACAGGCTCGCCAAGACGGGGGTGCCCATCTGGTTCACCGAGCTCGACGTGCCGGAGTACGACGTGGGCCTCCGCGCCAAGGACCTGGAGGTGGTGCTCCGGGAGGCGTACGCGCACCCGGCCGTGGAGGGCATCGTGTTCTGGGGCTTCATGCAGGGCACAATGTGGCGCCAGAACGCTTGGCTCGTCGACGCCGATGGCACCGTCAACGAGGCGGGCCAGATGTTCCTGAATCTGCAGAAGGAGTGGAAG 設(shè)計(jì)的引物 F:5' AGACCG GAATTC CGGACC TTGGACAACGCCTTC 3' 酶切位點(diǎn) EcoRI GC含量57.6% TM值70.1 R:5' ATT GCGGCCGC TTA TCA CTTCCACTCCTTCTGC 3' 酶切位點(diǎn) NotI GC含量54.5% TM值68.7 前后引物均加酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基 嘗試過(guò)退火溫度58-64均沒(méi)有P出來(lái)目的條帶還嘗試過(guò)55度也沒(méi)有p出來(lái) 不知道是什么原因 求各位大神指點(diǎn)，小妹不勝感激！ |
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-02-26 08:55:19
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-02-26 08:55:19
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設(shè)計(jì)的引物 F:5' AGACCG GAATTC CGGACC TTGGACAACGCCTTC 3' 酶切位點(diǎn) EcoRI GC含量57.6% TM值70.1 R:5' ATT GCGGCCGC TTA TCA CTTCCACTCCTTCTGC 3' 酶切位點(diǎn) NotI GC含量54.5% TM值68.7 你的引物設(shè)計(jì)的有問(wèn)題 比如說(shuō)R:5端 加酶切位點(diǎn)前后都加了保護(hù)堿基 ，而且你的保護(hù)堿基貌似也不對(duì)，有相應(yīng)的表的，http://wenku.baidu.com/link?url= ... wp-DAwczvXc81arqjsy； 我感覺(jué)可以設(shè)計(jì)成這樣R：5- AAGGAAAAAAGCGGCCGC CTTCCACTCCTTCTGC 3-；同理F也一樣。 另外注意 (1)酶及其濃度； (2)模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一； |
5樓2017-02-25 18:00:54
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