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[交流] 求助大神，分子基礎(chǔ)薄弱引物設(shè)計擴不出來!

我的目的基因序列TTGGACAACGCCTTCCCCTTCGGGACATGCATCAACACGTCCGTCATCCAGAAGCCGGCCTTCCTCGACTTCTTCACCAACCACTTCGACTGGGCCGTCTTCGAGAACGAGCTCAAGTGGTACCACACGGAGGTGCAGCAGGGCCAGCTCAACTACGCCGACGCCGACGCGCTGCTCGCGTTCTGCGACCGCCTGGGCAAGACCGTCCGCGGCCACTGCGTCTTCTGGTCCGTGGACGGCGACGTGCAGCAGTGGGTCAAGAACCTCAACAAGGACCAGCTCAGGTCCGCCATGCAGAGCCGCCTCGAGGGCCTCGTCTCCCGCTACGCCGGCAGGTTCAAGCACTACGACGTCAACAACGAGATGCTGCACGGCCGCTTCTTCCGGGACCGCCTCGGCGACGAGGACGTCCCGGCGTACATGTTCAAGGAGGTGGCGCGGCTGGACCCGGAGCCCGTGCTCTTCGTCAACGACTACAACGTGGAGTGCGGCAACGACCCCAACGCGACGCCGGAGAAGTACGCCGAGCAGGTCGCATGGCTGCAGAGCTGCGGCGCGGTGGTGCGCGGCATCGGGCTGCAGGGCCACGTGCAAAACCCGGTCGGGGAGGTCATCTGCGCCGCGCTCGACAGGCTCGCCAAGACGGGGGTGCCCATCTGGTTCACCGAGCTCGACGTGCCGGAGTACGACGTGGGCCTCCGCGCCAAGGACCTGGAGGTGGTGCTCCGGGAGGCGTACGCGCACCCGGCCGTGGAGGGCATCGTGTTCTGGGGCTTCATGCAGGGCACAATGTGGCGCCAGAACGCTTGGCTCGTCGACGCCGATGGCACCGTCAACGAGGCGGGCCAGATGTTCCTGAATCTGCAGAAGGAGTGGAAG

設(shè)計的引物  F:5'  AGACCG  GAATTC  CGGACC TTGGACAACGCCTTC  3' 酶切位點 EcoRI  GC含量57.6%  TM值70.1

               R:5'  ATT  GCGGCCGC  TTA  TCA  CTTCCACTCCTTCTGC  3'  酶切位點 NotI GC含量54.5% TM值68.7

前后引物均加酶切位點和保護堿基嘗試過退火溫度58-64均沒有P出來目的條帶還嘗試過55度也沒有p出來  不知道是什么原因

求各位大神指點，小妹不勝感激！

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1樓 2017-02-25 17:31:16

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莫等閑111

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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2017-02-26 08:55:19

設(shè)計的引物  F:5'  AGACCG  GAATTC  CGGACC TTGGACAACGCCTTC  3' 酶切位點 EcoRI  GC含量57.6%  TM值70.1

               R:5'  ATT  GCGGCCGC  TTA  TCA  CTTCCACTCCTTCTGC  3'  酶切位點 NotI GC含量54.5% TM值68.7
你的引物設(shè)計的有問題  比如說R:5端加酶切位點前后都加了保護堿基，而且你的保護堿基貌似也不對，有相應(yīng)的表的，http://wenku.baidu.com/link?url= ... wp-DAwczvXc81arqjsy；
我感覺可以設(shè)計成這樣R：5- AAGGAAAAAAGCGGCCGC  CTTCCACTCCTTCTGC 3-；同理F也一樣。
另外注意             (1)酶及其濃度；
                        (2)模板(靶基因)核酸模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一；

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5樓2017-02-25 18:00:54

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5樓: Originally posted by 莫等閑111 at 2017-02-25 18:00:54
設(shè)計的引物 F:5' AGACCG GAATTC CGGACC TTGGACAACGCCTTC 3' 酶切位點 EcoRI GC含量57.6% TM值70.1

R:5' ATT GCGGCCGC TTA TCA CTTCCACTCCTTCTGC 3' 酶切位點 NotI GC含量 ...

謝謝你，我的下游引物的保護堿基是按照一個碩士論文里添加的，我看他也用了NotI這個酶切位點

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7樓2017-02-25 18:08:15

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雁回首

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我是來學(xué)習(xí)的，小白一個剛接觸

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31樓2017-02-25 19:33:54

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34樓2017-02-25 20:26:36

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31樓: Originally posted by 雁回首 at 2017-02-25 19:33:54
我是來學(xué)習(xí)的，小白一個剛接觸

可以切磋一下

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37樓2017-02-25 21:00:46

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winteran

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你這基因不像CDS區(qū)啊

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42樓2017-02-25 21:22:04

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匿名

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45樓2017-02-25 21:24:25

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44樓: Originally posted by 哈哈狂風(fēng)暴雨 at 2017-02-25 21:24:15

怎么了？

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47樓2017-02-25 21:26:42

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42樓: Originally posted by winteran at 2017-02-25 21:22:04
你這基因不像CDS區(qū)啊

我這是全長CDS截取了一部分

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48樓2017-02-25 21:27:18

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22樓: Originally posted by 皖北+ at 2017-02-25 19:11:33

不要抱抱，要幫助

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50樓2017-02-25 21:28:44

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45樓: Originally posted by 陳小蘇 at 2017-02-25 21:24:25 是一

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