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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » PCR相關 » PCR出不來目的條帶
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yuevis銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
PCR出不來目的條帶
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我想overlap pcr把上下同源臂和目的基因連在一起，從基提取的細菌基因組上擴增上下同源臂，沒有目的條帶，有很多比目的條帶小或者接近的雜帶，請問這是怎么回事啊，很急啊，我的引物是這樣的 F1:AACTTGTGACGGAGGCG R1:CTGACGTATAGATGACATAAGCCAGATCTGTCGCTTCGGTGC F2:GCTTGCGAGAGGTTACCTGAACCGGCCGGAGCTGAC R2:TTCCAGCGGAGTCCGA 重疊區(qū)25bp左右，primer給的Tm是52和54左右，合成單上是54和56度左右，我試了退火溫度48，50，52，54，56效果都不好，雜帶很多，目的條帶有的沒有，有的很淡。我之前想的是就算特異性不好，之后膠收就行了，現在是連條帶都沒有，用的是fastpfu酶，做的10微升體系。求教各位啊! 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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5樓2017-12-02 16:29:20
2樓2017-11-30 06:33:35
yuevis
銅蟲 (小有名氣)
- 應助: 0 (幼兒園)
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- 注冊: 2016-09-08
- 性別: GG
- 專業(yè): 系統生物學
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剛開始做，很多不懂，我想的是那10微升試條件的，體系會有很大影響嗎?還有出現很多雜帶是不是說明提取的基因組和體系是沒問題的?一般用什么酶?實驗室只有fastpfu酶 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2017-11-30 07:05:56
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你這應該是要做載體的吧?用高保真的酶，引物設計可以用http://www.clontech.com/上面的infusion工具設計，我試過不錯的。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2017-11-30 12:28:48
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