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小李紙11銀蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
求助，現(xiàn)在需要自己構(gòu)建重組質(zhì)粒，怎樣選擇合適的限制性?xún)?nèi)切酶呢。。。 已有3人參與
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| 我已經(jīng)把含有目的基因的質(zhì)粒從大腸桿菌里提出來(lái)了，現(xiàn)在需要把它從該質(zhì)粒上切下來(lái)，然后連接到畢赤酵母的空質(zhì)粒上，請(qǐng)問(wèn)我該如何選擇合適的酶進(jìn)行切割呢？需要考慮的因素有哪些呢？還有。。。是用雙酶切還是單酶切比較合適呢？謝謝啦。。。 |
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原海亮
木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 232 (大學(xué)生)
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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在草稿紙上自己畫(huà)畫(huà)，其實(shí)是可以琢磨清楚的。像這樣將目的基因從一個(gè)載體轉(zhuǎn)換到另一個(gè)載體上，也稱(chēng)為亞克隆，常用的方法就是酶切和pcr，而有合適酶的話，酶切常常是首選。酶切做亞克隆，你需要掌握實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)主角的信息:已經(jīng)連有目的基因的載體和待連接的酵母載體的序列和圖譜，這樣你才有可能知道兩個(gè)載體上現(xiàn)在都有哪些酶切位點(diǎn)，也就是你可以選擇哪些酶（你可以在草稿紙上分別列出）。首先你要知道，進(jìn)行酶切連接，是需要兩個(gè)片段具有相同的粘性末端，即片段和載體要經(jīng)過(guò)相同的酶切處理。那么實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，你從現(xiàn)有載體切下來(lái)片段去和另一個(gè)載體連接，那么你用哪個(gè)酶來(lái)切呢？原則就是你切下目的片段所用的酶，在酵母載體上也要有這個(gè)酶，這樣才可以確保，你從其他載體拿過(guò)來(lái)的東西在它這同樣能接受。關(guān)于你說(shuō)的載體加保護(hù)堿基酶切，應(yīng)該是你誤解的，載體酶切位點(diǎn)外側(cè)已經(jīng)有堿基，不需要人為加的，而通常是進(jìn)行pcr時(shí)，會(huì)在引物酶切位點(diǎn)兩端加保護(hù)堿基，這是因?yàn)閜cr產(chǎn)物是線性的，兩端就是酶切位點(diǎn)，而這樣裸露的位點(diǎn)，酶切時(shí)效率很低，所以就人為的給多加了幾個(gè)堿基，方便酶切，即所謂的保護(hù)堿基。另一個(gè)移碼突變，這個(gè)對(duì)于克隆載體來(lái)說(shuō)，多克隆位點(diǎn)就是專(zhuān)門(mén)提供給你來(lái)插入片段的，而啟動(dòng)子就在多克隆位點(diǎn)上游，如果你的目的基因起始密碼子和終止密碼子都有，而你目的片段和啟動(dòng)子直接沒(méi)有起始密碼子，就不用擔(dān)心會(huì)移碼突變，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄翻譯只有從你的起始密碼子開(kāi)始，沒(méi)有其他選擇（有些融合表達(dá)載體或者加標(biāo)簽載體除外）。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
蓉蓉aa
6樓2016-03-15 21:03:45
2樓2016-03-15 11:28:45
小李紙11
銀蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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- 專(zhuān)業(yè): 基因表達(dá)調(diào)控與表觀遺傳學(xué)
3樓2016-03-15 11:55:55
4樓2016-03-15 13:24:33
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