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小李紙11銀蟲 (正式寫手)
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[求助]
求助，現(xiàn)在需要自己構(gòu)建重組質(zhì)粒，怎樣選擇合適的限制性內(nèi)切酶呢。。。 已有3人參與
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| 我已經(jīng)把含有目的基因的質(zhì)粒從大腸桿菌里提出來了，現(xiàn)在需要把它從該質(zhì)粒上切下來，然后連接到畢赤酵母的空質(zhì)粒上，請問我該如何選擇合適的酶進(jìn)行切割呢？需要考慮的因素有哪些呢？還有。。。是用雙酶切還是單酶切比較合適呢？謝謝啦。。。 |
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原海亮
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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在草稿紙上自己畫畫，其實(shí)是可以琢磨清楚的。像這樣將目的基因從一個(gè)載體轉(zhuǎn)換到另一個(gè)載體上，也稱為亞克隆，常用的方法就是酶切和pcr，而有合適酶的話，酶切常常是首選。酶切做亞克隆，你需要掌握實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)主角的信息:已經(jīng)連有目的基因的載體和待連接的酵母載體的序列和圖譜，這樣你才有可能知道兩個(gè)載體上現(xiàn)在都有哪些酶切位點(diǎn)，也就是你可以選擇哪些酶（你可以在草稿紙上分別列出）。首先你要知道，進(jìn)行酶切連接，是需要兩個(gè)片段具有相同的粘性末端，即片段和載體要經(jīng)過相同的酶切處理。那么實(shí)驗(yàn)開始，你從現(xiàn)有載體切下來片段去和另一個(gè)載體連接，那么你用哪個(gè)酶來切呢？原則就是你切下目的片段所用的酶，在酵母載體上也要有這個(gè)酶，這樣才可以確保，你從其他載體拿過來的東西在它這同樣能接受。關(guān)于你說的載體加保護(hù)堿基酶切，應(yīng)該是你誤解的，載體酶切位點(diǎn)外側(cè)已經(jīng)有堿基，不需要人為加的，而通常是進(jìn)行pcr時(shí)，會在引物酶切位點(diǎn)兩端加保護(hù)堿基，這是因?yàn)閜cr產(chǎn)物是線性的，兩端就是酶切位點(diǎn)，而這樣裸露的位點(diǎn)，酶切時(shí)效率很低，所以就人為的給多加了幾個(gè)堿基，方便酶切，即所謂的保護(hù)堿基。另一個(gè)移碼突變，這個(gè)對于克隆載體來說，多克隆位點(diǎn)就是專門提供給你來插入片段的，而啟動子就在多克隆位點(diǎn)上游，如果你的目的基因起始密碼子和終止密碼子都有，而你目的片段和啟動子直接沒有起始密碼子，就不用擔(dān)心會移碼突變，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄翻譯只有從你的起始密碼子開始，沒有其他選擇（有些融合表達(dá)載體或者加標(biāo)簽載體除外）。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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蓉蓉aa
6樓2016-03-15 21:03:45
2樓2016-03-15 11:28:45
原海亮
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【答案】應(yīng)助回帖
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小李紙11: 金幣+8, ★★★★★最佳答案 2016-03-17 14:13:07
小李紙11: 金幣+8, ★★★★★最佳答案 2016-03-17 14:13:07
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沒有合適的酶切位點(diǎn)，就需要通過pcr方法將目的基因從載體上擴(kuò)增下來，這時(shí)候就只用考慮酵母載體的酶切位點(diǎn)就行，選擇好之后，就在設(shè)計(jì)引物時(shí)把選好的酶切位點(diǎn)加到引物的5’端，然后加保護(hù)堿基就OK 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2016-03-16 18:24:21
小李紙11
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3樓2016-03-15 11:55:55
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5樓2016-03-15 14:27:24
小李紙11
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7樓2016-03-16 18:04:30
小李紙11
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8樓2016-03-16 18:18:17
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10樓2016-03-16 18:55:37
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