蛋白誘導表達低或不表達
以前表達蛋白一直是包涵體的問題,這次頭一次遇到誘導不出來的:
第一張圖是IPTG誘導前和誘導后的對比,幾乎沒有差別.蛋白大小應該是92kDa,只能看到很淺的條帶
可以肯定的是蛋白是可溶的,因為以前表達過這個蛋白,這一次我在蛋白N端的his-tag后面添了幾個氨基酸,增加了一個酶切位點,便于純化后把histag切掉,結(jié)果誰想就不表達了
表達條件是LB, 19度,1mM IPTG,過夜
BL21 DE3 codon plus, pet28質(zhì)粒
其實以前這個蛋白一直有誘導表達量不好的問題. 第2張圖,右邊的7個泳道是同樣這個蛋白但是我沒有在histag后面添加個酶切位點.左邊7個泳道是另一個蛋白用同一個載體質(zhì)粒,完全一致的插入位點和完全一致的誘導條件,就誘導表達得很好
親們有什么優(yōu)化意見嗎?
histevh1induction.jpg
ecatbody_and_hish1.jpg
[ Last edited by fuyuandj86 on 2013-8-9 at 22:47 ]
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京公網(wǎng)安備 11010802022153號
關鍵問題是你要干啥？都能看見帶了純化出來干啥不夠��？不用擔心了，搖500ml, 純出來做實驗吧。。。
主要是第一張圖,N端添加了7個氨基酸以后誘導前誘導后幾乎沒差別了...
這個是要用來做高通量篩選.
以第二張圖右邊組的誘導量還是可以接受的,我搖了10L,最后搞出來6-7mg
，
簡單的加個酶切位點就發(fā)生了如此大的變化，一般是不可能的，所以我建議你在此測序看看，確保沒有移碼！
nature以前有一篇論文專門討論了稀有氨基酸對蛋白表達影響很大，所以我覺得還是非常有可能變小的，移碼可能性不大。我的蛋白表達量是樓主的1/N,SDS-PAGE上看不到差別，Western才能看到表達。多搖點，純出來就好了。