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sysg07124新蟲 (初入文壇)
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抗體與核酸共價(jià)連接，sulfo-SMCC做交聯(lián)劑 已有1人參與
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現(xiàn)在做一個(gè)需要將抗體和核酸共價(jià)連接的實(shí)驗(yàn)，sulfo-SMCC做交聯(lián)劑，開始用SMCC先活化抗體（室溫2小時(shí)），然后用DTT還原巰基DNA（37℃ 1小時(shí)），分別過脫鹽柱后混合透析，得到的產(chǎn)物跑SDS-PAGE，考藍(lán)染色，在泳道的最頂端出現(xiàn)了條帶（與marker相比分子量超過了250 kDa）。經(jīng)驗(yàn)證，SMCC只與抗體混合，室溫靜置半小時(shí)就可以在泳道上端產(chǎn)生明顯的條帶，應(yīng)該是抗體之間發(fā)生了交聯(lián)。 然后又考慮用氨基的探針先與SMCC室溫震蕩孵育3小時(shí)，然后再與抗體孵育過夜，SDS-PAGE，考藍(lán)染色，條帶與純抗體的對照完全沒有差別。問題到底出在哪里，誰有具體的實(shí)驗(yàn)步驟可供參考？ 附件1.jpg@biostar2009 |
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2樓2017-10-02 20:19:54
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-10-02 23:25:52
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-10-02 23:25:52
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產(chǎn)生抗體與抗體的偶聯(lián)應(yīng)該是不可避免的，可能你需要計(jì)算好蛋白和核酸的摩爾比，用摩爾比遠(yuǎn)過量的巰基核酸做反應(yīng)試試看，應(yīng)該會(huì)一定程度上降低蛋白之間的偶聯(lián)。另外，反應(yīng)時(shí)盡量把蛋白調(diào)到較低濃度，降低蛋白互相之間碰撞偶聯(lián)的幾率 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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3樓2017-10-02 20:32:51
4樓2017-10-02 20:42:32
sysg07124
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抗體與SMCC反應(yīng)的時(shí)候還沒有加核酸，所以應(yīng)該不是抗體和核酸的比例問題吧。我想過稀釋抗體，但是抗體與SMCC反應(yīng)之后我是用一個(gè)最大上樣量12微升的脫鹽柱除過量SMCC的，如果稀釋太多實(shí)驗(yàn)的成本上耗不起啊 另外我想問一下，你知道為什么如果SMCC先和氨基的DNA反應(yīng)，除鹽之后再與抗體孵育，理論上不是也可以嗎，為什么我的電泳顯示一點(diǎn)也沒有標(biāo)上去？如果SMCC能讓這個(gè)抗體產(chǎn)生這么嚴(yán)重的交聯(lián)，它表面的巰基應(yīng)該挺多的吧？ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
5樓2017-10-02 20:58:40
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6樓2017-10-02 21:00:09
sysg07124
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請問加螯合劑的作用是什么？抗體與SMCC的反應(yīng)我用的1X PBS，之后巰基DNA的還原和脫鹽后與抗體的孵育緩沖液我都加了EDTA的 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
7樓2017-10-02 21:00:51
sysg07124
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8樓2017-10-03 22:48:35
sysg07124
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第一條泳道是純抗體對照，后面四個(gè)分別是四次標(biāo)記的結(jié)果，后兩個(gè)是不是就已經(jīng)算標(biāo)上了，好像這種連接本身的效率就不是很高？ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
9樓2017-10-03 22:50:40
10樓2017-10-04 02:16:54
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