pMD-19T載體與目的片段的連接問題
之前計劃目的基因（3.6Kb）與pMD-19T進行TA克隆連接，目的片段用primerstar高保真酶后加A連接，氨芐板生長，鑒定后發(fā)現(xiàn)是載體自連；后來用Taq酶PCR擴增后直接與pMD-19T載體鏈接，最后發(fā)現(xiàn)還是自連的···發(fā)現(xiàn)這都不行后就進行一步克�。–lonExpressTM快速克隆技術(shù)），之前認為在載體是線性的，就直接連了，但是沒有連上，氨芐平板上沒長；后來用以前構(gòu)建好的質(zhì)粒進行雙酶切后進行一步克隆，可是氨芐平板上還是沒有長···各位大神，求助···
轉(zhuǎn)化條件：
感受態(tài)是自己用氯化鈣法做的，以前也是用它來做轉(zhuǎn)化，都可以的···
熱擊90s后，37℃活化1h后，將轉(zhuǎn)化液濃縮全部涂平板···
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京公網(wǎng)安備 11010802022153號
我覺得第一次做的比較好，因為第二次你沒有純化。
個人覺得是你連接體系出問題了，你可以把具體信息寫下來給你看看。
熱擊90s后，要記得冰上5min，然后加SOC,再37度恢復培養(yǎng)。
連接效率太低，PCR產(chǎn)物要純化
你用Taq DNA聚合酶進行PCR之后進行相應(yīng)的酶切就直接連接載體了嗎？
構(gòu)建質(zhì)粒的一般步驟：
擴增目的基因---PCR產(chǎn)物純化，加17ul 洗脫液洗脫（PCR產(chǎn)物純化試劑盒做）---雙酶切，30或50ul 體系，純化后的PCR產(chǎn)物取 10ul，載體取 3ul，37度 約3-4h---膠回收（膠回收試劑盒做），加17ul 洗脫液洗脫----連接，16度，約3-4h----轉(zhuǎn)化，熱激時，42度，40 s 即可----后培養(yǎng)，加200 ul 液體LB ，37度靜止培養(yǎng) 1 h----取200 ul 涂氨芐。
純化是什么意思？載體和目的片段都是跑膠回收的···熱擊后，我冰浴了2min，然后才活化的···
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載體和目的片段都是跑膠回收過的，應(yīng)該算是純化了吧···
之前認為是Taq酶P出來就存在A尾，就直接連接了，發(fā)現(xiàn)載體自連了，后來P出來之后，又用加A試劑盒加A尾進行連接轉(zhuǎn)化，鑒定后還是沒連上···