pMD-19T載體與目的片段的連接問題
之前計劃目的基因（3.6Kb）與pMD-19T進(jìn)行TA克隆連接，目的片段用primerstar高保真酶后加A連接，氨芐板生長，鑒定后發(fā)現(xiàn)是載體自連；后來用Taq酶PCR擴(kuò)增后直接與pMD-19T載體鏈接，最后發(fā)現(xiàn)還是自連的···發(fā)現(xiàn)這都不行后就進(jìn)行一步克�。–lonExpressTM快速克隆技術(shù)），之前認(rèn)為在載體是線性的，就直接連了，但是沒有連上，氨芐平板上沒長；后來用以前構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后進(jìn)行一步克隆，可是氨芐平板上還是沒有長···各位大神，求助···
轉(zhuǎn)化條件：
感受態(tài)是自己用氯化鈣法做的，以前也是用它來做轉(zhuǎn)化，都可以的···
熱擊90s后，37℃活化1h后，將轉(zhuǎn)化液濃縮全部涂平板···
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京公網(wǎng)安備 11010802022153號
步驟我都知道的···
，
加A試劑盒不會有問題吧？轉(zhuǎn)化后是怎么鑒定的��？
純化就是跑膠回收，現(xiàn)在看來最大可能是連接這里有點(diǎn)小問題了吧。
把連接體系寫上來，以及片段載體多大，濃度多大。
這個載體應(yīng)該是可以做藍(lán)白斑篩選的吧，做個藍(lán)白斑很容易就能看出來有沒有插入基因。一般白斑的插入率應(yīng)該有90%，你的目的片段略大，可能會稍微低一些。確認(rèn)一下這個大小是否超過了載體的上限。
不知道你的連接體系是怎樣的，你的片段跟載體的大小基本差不多，所以要多加目的片段進(jìn)行連接，用3：1甚至5：1的比例，加大目的片段的插入效率。沒用過這個載體，也確認(rèn)一下這個載體是不是能直接用來TA克隆。
至于你后來說的雙酶切后進(jìn)一步克隆，體系是怎樣的？你的目的基因有相應(yīng)的酶切位點(diǎn)么？
你好，可能是你的目的片段太長了。。 建議您換一下連接體系。 PMD19-T中，T4連接酶在solution I 里，好像本身連接效率就不高，況且你的片段3.6K
原因是片段太長， 3.6K要連上去很難，因為載體也差不多是這么大。考慮把3.6k擴(kuò)3個小1k左右的小片段，分步連上去。需要找到重合處的唯一內(nèi)切酶位點(diǎn)。
這樣的話，如果3個小片段有任何一個出現(xiàn)問題，那我的蛋白不就表達(dá)不了了嗎？？？