各位前輩：
      我最近在做酵母的轉(zhuǎn)化實驗，用到兩個質(zhì)粒一個是cas9質(zhì)粒一個是pYES2質(zhì)粒，用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，具體方法如下：
1.        挑取單克隆酵母BY4741于10 ml YPD培養(yǎng)基中，30℃，250 rpm過夜培養(yǎng)。
2.        測定過夜培養(yǎng)之后的OD600，轉(zhuǎn)接于50 ml YPD培養(yǎng)基中，使初始OD600=0.4，細胞數(shù)目約為5×106 。繼續(xù)培養(yǎng)2-4 h，使OD600=1.3-1.5，細胞個數(shù)約為2×107。
3.        用50 ml 離心管，2500 rpm，5 min 離心，收集菌體，在40 ml 1×TE懸浮。
4.        2500 rpm，5 min 離心，去上清，收集菌體重懸于2 ml 1×LiAc/0.5 TE 中。
5.        在室溫下靜置10 min。
6.        然后依次加入1 μg的質(zhì)粒，100 μl的酵母懸液，700 μl 1×LiAc/40%PEG3350/1×TE，劇烈振蕩1 min 。在30℃情況下孵育30 min。
7.        加入88 μl DMSO，混勻，在42℃下熱激7min（或20 min-25 min）
8.        2500 rpm ，5 min 離心，去除上清，在200 μl 1× TE中重懸。
9.        涂布于選擇培養(yǎng)基含有G418的培養(yǎng)基（G418濃度：200 μg/ml）
10.        將平板在30 ℃培養(yǎng)2-3天。
可是連著做了幾次了平板上都沒有轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)，想問下大家問題出在哪里了，或者有什么可以改進的地方嗎. 返回小木蟲查看更多