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靈思生物金蟲 (正式寫手)
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微生物多樣性測(cè)序16S rRNA
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微生物多樣性測(cè)序16s rrna 1.技術(shù)簡(jiǎn)介菌群多樣性組成譜測(cè)序以細(xì)菌或者古菌的16s rrna 基因可變區(qū)、真菌 18s rrna 基因可變區(qū)或真菌 its（internaltranscribed spacer）內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)等微生物特征序列（signature sequence）或者某些特定功能的基因位點(diǎn)（功能基因或擴(kuò)增子）為靶位點(diǎn)，通過檢測(cè)序列的變異和數(shù)量，反映菌群中各類微生物物種的身份和豐度，從而快速了解菌群物種分布特征，闡明樣本間多樣性和組成差異，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)差異相關(guān)物種。（16s rrna是原核生物的核糖體中30s亞基的組成部分，長(zhǎng)度約為1542nt，具有高度的保守性和特異性。16s rrna基因是細(xì)菌上編碼rrna相對(duì)應(yīng)的dna序列，存在于所有細(xì)菌的基因組中。包含保守區(qū)和可變區(qū)，保守區(qū)反映了物種間的親緣關(guān)系，可變區(qū)反映了物種間的差異。16s rrna基因測(cè)序一般是利用miseq對(duì)16s rrna基因的v3-v4可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序，以此來研究微生物的多樣性。）豐度：是指一種化學(xué)元素在某個(gè)自然體中的重量占這個(gè)自然體總重量的相對(duì)份額（如百分?jǐn)?shù)）。豐度表示方法主要分為重量豐度、原子豐度和相對(duì)豐度。 2.技術(shù)路線 2.1樣品準(zhǔn)備： 樣本類型：土壤/污泥 糞便 血液 樣本要求：1-5g 1-5g ≥2ml ★ 動(dòng)物類樣品 1. 糞便：用滅菌的 2.0ml 離心管保存，單個(gè)樣本取樣量：0.5-1.0g/管，如不能及時(shí)送樣，請(qǐng) -80 攝氏度冰箱冷凍保存。為保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，每個(gè)樣本取 3-5 管備份，寄送樣本時(shí) 選擇干冰或足量冷凍冰袋運(yùn)輸，寄送到公司時(shí)，樣品仍處在冷凍狀態(tài)。 注：如糞便樣品量較多或不能馬上收集，最遲要在 2 小時(shí)之內(nèi)全部收集完。 2. 腸道內(nèi)容物：用無菌手術(shù)刀刮取或鑷子擠出內(nèi)容物，用滅菌的 2.0ml 離心管保存，單個(gè)樣本取樣量：0.5-1.0g/管，如不能及時(shí)送樣，請(qǐng)-80 攝氏度冰箱冷凍保存。為保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，每個(gè)樣本取 3-5 管備份，寄送樣本時(shí)選擇干冰或足量冷凍冰袋運(yùn)輸，寄送到公司時(shí)，樣品仍處在冷凍狀態(tài)。 3. 腸道組織：新鮮的組織樣本用無菌磷酸鹽緩沖液 (1*pbs ，ph=7.2) 輕輕清洗，直到?jīng)]有內(nèi)容物流出；用無菌的顯微鏡玻片刮取附著在表面的組織微生物，用滅菌的 2.0ml 螺口 ep 管保存，液氮速凍 15min 以上，如不能及時(shí)送樣，請(qǐng)-80 攝氏度冰箱冷凍保存。為保證 實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，每個(gè)樣本取 3-5 管備份，寄送樣本時(shí)選擇干冰或足量冷凍冰袋運(yùn)輸，寄送到公司時(shí)，樣品仍處在冷凍狀態(tài)。 4. 生殖道樣本：消毒外陰或尿道口，無菌棉簽拭子拭取宮頸口或?qū)m頸后穹窿的分泌物，不可碰及陰 道壁，圓周滾動(dòng) 5 次，充分取樣，用無菌剪刀剪下棉簽頭部，放入裝有 amies 培養(yǎng)基的 無菌離心管中，如不能及時(shí)送樣，請(qǐng)-80 攝氏度冰箱冷凍保存。為保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，每個(gè)樣本取 3-5 管備份，寄送樣本時(shí)選擇干冰或足量冷凍冰袋運(yùn)輸，寄送到公司時(shí)樣品仍處在冷凍狀態(tài)。 5. 唾液樣本：用滅菌的 2.0ml 離心管，每管收集 1~2ml，-80 攝氏度冰箱冷凍保存。為保證實(shí)驗(yàn)順 利進(jìn)行，每個(gè)樣本取 3-5 管備份，寄送樣本時(shí)選擇干冰或足量冷凍冰袋運(yùn)輸，寄送到公 司時(shí)樣品仍處在冷凍狀態(tài)。 ★環(huán)境類樣品 1. 土壤樣本：用滅菌的 2.0ml 離心管或小自封袋，每份 0.5~2g，如不能及時(shí)送樣，請(qǐng)-80 攝氏度 冰箱冷凍保存。為保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，每個(gè)樣本取 3-5 管備份，寄送樣本時(shí)選擇干冰或 足量冷凍冰袋運(yùn)輸，寄送到公司時(shí)，樣品仍處在冷凍狀態(tài)。 注：土壤類樣品，應(yīng)避免送樣過多，造成保存空間緊張。 2. 水體樣本 (含污水、尿液等液態(tài)樣本)：水樣需要通過相應(yīng)孔徑的濾膜進(jìn)行過濾，過濾后微生物會(huì)截留在濾膜上，將濾膜置于離心管中，如不能及時(shí)送樣，請(qǐng)-80 攝氏度冰箱冷凍保存。由于材質(zhì)問題，冷凍后的濾膜較脆易碎，建議冷凍時(shí)間不要太久，盡快送樣。為保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，每個(gè)樣本取 3-5 管備份，寄送樣本時(shí)選擇干冰或足量冷凍冰袋運(yùn)輸，寄送到公司時(shí)，樣品仍處在冷凍狀態(tài)。 注：微孔濾膜建議使用 0.45μm 和0.22μm 孔徑，0.45μm 富集真菌類或者直徑更大的微生物；0.22μm 富集細(xì)菌類或者直徑更大的生物，可根據(jù)科研需要選擇合適孔徑的濾膜。 ★ 食品類樣品 1. 固體類：總量>20g，用滅菌的 2.0ml 離心管分裝，如不能及時(shí)送樣，請(qǐng)-80 攝氏度冰箱冷凍 保存。為保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，每個(gè)樣本取 3-5 管備份，寄送樣本時(shí)選擇干冰或足量冷凍 冰袋運(yùn)輸，寄送到公司時(shí)，樣品仍處在冷凍狀態(tài)。 2. 液體類：液態(tài)類建議進(jìn)行過膜處理后按照水體送樣進(jìn)行，無條件時(shí)可進(jìn)行原樣送樣，總體積 30-50ml，用 50ml 離心管分裝， 4 度冷藏保存，足量冷凍冰袋運(yùn)輸，寄送到公司時(shí)，冰袋仍處在冷凍狀態(tài)。 2.2實(shí)驗(yàn)流程 樣本中微生物組總dna提�。ㄙ|(zhì)量檢測(cè)）→目標(biāo)片段pcr擴(kuò)增（純化回收） →擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)定量→測(cè)序文庫制備→上機(jī)進(jìn)行高通量測(cè)序→生信分 析 （常用的生物信息分析軟件主要是qilme，包括otu聚類及多樣性等多 種分析，還有詳細(xì)的文檔說明。） 2.3生信分析流程3.主要結(jié)果展示（部分標(biāo)準(zhǔn)分析內(nèi)容）標(biāo)準(zhǔn)分析解決問題物種注釋進(jìn)行物種注釋及各物種豐度信息α-多樣性分析微生物群落的豐富度和多樣性β-多樣性分析不同樣本（組）間的微生物群落 及各樣本（組）差異情況多元統(tǒng)計(jì)分析尋找組間具有顯著差異的物種，同時(shí)可以比較組內(nèi)差異和組間差異的大小，判斷分組是否有意義功能預(yù)測(cè)預(yù)測(cè)樣本的功能組成 |
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