qPCR標曲正常，但是結果比理論值高1~2個數量級，求大家?guī)兔Ψ治鲈颉?/h1>
大家好，我這邊最近做qPCR絕對定量遇到一個現象，就是qPCR的結果和我的菌液鏡檢結果相差1~2個數量級，下面把結果和實驗中的一些參數給大家看看，請幫忙分析一下。
我的qPCR結果顯示我菌液濃度約為8E+11copies/ml，顯微鏡檢結果約為3E+9個/ml。
由于不確定細菌基因拷貝數，假如拷貝數為10，qPCR的結果仍然是8E+10 cell/ml，還是比顯微鏡檢高了1個數量級。
雖然顯微鏡檢也是相對定量，結果有與實際值有偏差，但是10倍差在顯微鏡下差異還是很大的。
我是提取的質粒DNA，用qubit測的濃度為84ng/μl，目的片段堿基數分別為A:T:C:G=59:50:73:95（合計277），質粒用的pMD-19T堿基數A:T:C:G=662：:69:676:686（合計2693），計算公式為：標品拷貝數=84x(6.02E+23)/(277+2693)/660，質粒標品濃度為2.58E+10 copies/μl，質粒進行10倍梯度稀釋取2~8次方進行qPCR檢測。
標準曲線參數：擴增效率90.6%，R2=0.999，slope=-3.571
溶劑曲線：單峰，無非特異性擴增
樣品DNA稀釋100倍進行qPCR檢測，下機拷貝數為：1.56E+7 copies/μl
用0.2ml菌液離心洗滌，400μl重懸破壁后取上清200μl提DNA，50μl去離子水洗脫，
DNA拷貝數計算公式為：菌液DNA含量（copies/ml）=（1.56E+7）x100x50x2/0.2，結果約為8E+11copies/ml
小木蟲今天沒法上傳圖片，只能辛苦大家看文字版了，謝謝！
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我的qPCR結果顯示我菌液濃度約為8E+11copies/ml，顯微鏡檢結果約為3E+9個/ml。
由于不確定細菌基因拷貝數，假如拷貝數為10，qPCR的結果仍然是8E+10 cell/ml，還是比顯微鏡檢高了1個數量級。
雖然顯微鏡檢也是相對定量，結果有與實際值有偏差，但是10倍差在顯微鏡下差異還是很大的。
我是提取的質粒DNA，用qubit測的濃度為84ng/μl，目的片段堿基數分別為A:T:C:G=59:50:73:95（合計277），質粒用的pMD-19T堿基數A:T:C:G=662：:69:676:686（合計2693），計算公式為：標品拷貝數=84x(6.02E+23)/(277+2693)/660，質粒標品濃度為2.58E+10 copies/μl，質粒進行10倍梯度稀釋取2~8次方進行qPCR檢測。
標準曲線參數：擴增效率90.6%，R2=0.999，slope=-3.571
溶劑曲線：單峰，無非特異性擴增
樣品DNA稀釋100倍進行qPCR檢測，下機拷貝數為：1.56E+7 copies/μl
用0.2ml菌液離心洗滌，400μl重懸破壁后取上清200μl提DNA，50μl去離子水洗脫，
DNA拷貝數計算公式為：菌液DNA含量（copies/ml）=（1.56E+7）x100x50x2/0.2，結果約為8E+11copies/ml
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