qPCR標(biāo)曲正常，但是結(jié)果比理論值高1~2個(gè)數(shù)量級(jí)，求大家?guī)兔Ψ治鲈颉?/h1>
大家好，我這邊最近做qPCR絕對(duì)定量遇到一個(gè)現(xiàn)象，就是qPCR的結(jié)果和我的菌液鏡檢結(jié)果相差1~2個(gè)數(shù)量級(jí)，下面把結(jié)果和實(shí)驗(yàn)中的一些參數(shù)給大家看看，請(qǐng)幫忙分析一下。
我的qPCR結(jié)果顯示我菌液濃度約為8E+11copies/ml，顯微鏡檢結(jié)果約為3E+9個(gè)/ml。
由于不確定細(xì)菌基因拷貝數(shù)，假如拷貝數(shù)為10，qPCR的結(jié)果仍然是8E+10 cell/ml，還是比顯微鏡檢高了1個(gè)數(shù)量級(jí)。
雖然顯微鏡檢也是相對(duì)定量，結(jié)果有與實(shí)際值有偏差，但是10倍差在顯微鏡下差異還是很大的。
我是提取的質(zhì)粒DNA，用qubit測(cè)的濃度為84ng/μl，目的片段堿基數(shù)分別為A:T:C:G=59:50:73:95（合計(jì)277），質(zhì)粒用的pMD-19T堿基數(shù)A:T:C:G=662：:69:676:686（合計(jì)2693），計(jì)算公式為：標(biāo)品拷貝數(shù)=84x(6.02E+23)/(277+2693)/660，質(zhì)粒標(biāo)品濃度為2.58E+10 copies/μl，質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋取2~8次方進(jìn)行qPCR檢測(cè)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)：擴(kuò)增效率90.6%，R2=0.999，slope=-3.571
溶劑曲線：?jiǎn)畏澹瑹o(wú)非特異性擴(kuò)增
樣品DNA稀釋100倍進(jìn)行qPCR檢測(cè)，下機(jī)拷貝數(shù)為：1.56E+7 copies/μl
用0.2ml菌液離心洗滌，400μl重懸破壁后取上清200μl提DNA，50μl去離子水洗脫，
DNA拷貝數(shù)計(jì)算公式為：菌液DNA含量（copies/ml）=（1.56E+7）x100x50x2/0.2，結(jié)果約為8E+11copies/ml
小木蟲(chóng)今天沒(méi)法上傳圖片，只能辛苦大家看文字版了，謝謝！
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由于不確定細(xì)菌基因拷貝數(shù)，假如拷貝數(shù)為10，qPCR的結(jié)果仍然是8E+10 cell/ml，還是比顯微鏡檢高了1個(gè)數(shù)量級(jí)。
雖然顯微鏡檢也是相對(duì)定量，結(jié)果有與實(shí)際值有偏差，但是10倍差在顯微鏡下差異還是很大的。
我是提取的質(zhì)粒DNA，用qubit測(cè)的濃度為84ng/μl，目的片段堿基數(shù)分別為A:T:C:G=59:50:73:95（合計(jì)277），質(zhì)粒用的pMD-19T堿基數(shù)A:T:C:G=662：:69:676:686（合計(jì)2693），計(jì)算公式為：標(biāo)品拷貝數(shù)=84x(6.02E+23)/(277+2693)/660，質(zhì)粒標(biāo)品濃度為2.58E+10 copies/μl，質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋取2~8次方進(jìn)行qPCR檢測(cè)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)：擴(kuò)增效率90.6%，R2=0.999，slope=-3.571
溶劑曲線：?jiǎn)畏澹瑹o(wú)非特異性擴(kuò)增
樣品DNA稀釋100倍進(jìn)行qPCR檢測(cè)，下機(jī)拷貝數(shù)為：1.56E+7 copies/μl
用0.2ml菌液離心洗滌，400μl重懸破壁后取上清200μl提DNA，50μl去離子水洗脫，
DNA拷貝數(shù)計(jì)算公式為：菌液DNA含量（copies/ml）=（1.56E+7）x100x50x2/0.2，結(jié)果約為8E+11copies/ml
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