重疊延伸PCR目的條帶純化后擴(kuò)增依然是非特異條帶
最近做重疊延伸PCR連片段，一直有非特異擴(kuò)增，單獨(dú)將目的基因切下再做pcr還是非特異擴(kuò)增，我是三個(gè)片段連接，這個(gè)非特異好像是兩端的連上了中間的片段的非特異小片段，做過很多次稀釋，也做過巢式PCR，還有不斷的純化，都只是p出那條非特異，各位大神有什么建議？純化過的片段在加引物很難P，是不是都是這樣��？圖一是有目的片段的，圖二是純化后只有非特異的片段。
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建議樓主先將兩個(gè)片段通過重疊延伸PCR連接到一起，連接成功后再連接第三個(gè)，