對液相色譜來說，色譜柱是核心。對分離純化來說，一根高效、穩(wěn)定的色譜柱是關(guān)鍵。分離純化不同樣品，需要用到不同的柱子，今天小編想跟大家聊一聊C18反相分離柱。


C18是連接十八烷基碳鏈的反相固定相的總稱。除了常見的硅膠為基質(zhì)外，高聚物小球、氧化鋁、氧化鋯等為基質(zhì)鍵合C18鏈形成的反相固定相,都可以稱為" C18"。C18的種類有很多,常見的硅膠基質(zhì)C18通常被稱為ODS，能在純水下運行的C18則被稱為C18-AQ。

C18反相柱的固定相是非極性固定相，流動相極性大于固定相極性，常用溶劑一般為水和甲醇、乙腈、四氫呋喃、異丙醇等與水互溶的溶劑，適應于分離非極性或弱極性的化合物，其樣品洗脫順序為樣品極性由高到低。



C18反相分離柱應用范圍

C18反相分離柱廣泛應用在天然產(chǎn)物提取、醫(yī)藥合成研發(fā)以及生物制藥等多個方向。如果您的樣品極性偏大、Rf值很近，正相模式無法分開；終產(chǎn)物要求純度98%以上、采用正相模式無法達到；在正相條件存在溶解問題的樣品——以上情況不妨考慮采用反相C18模式進行分離。目前C18柱因其填料鍵合技術(shù)的成熟和出色的分離能力，已成為分離純化研究人員日常接觸最多的反相柱。


C18反相分離柱的主要參數(shù)
C18分離柱的參數(shù)有很多，大致分為四個方面：鍵合相（包括修飾、封端）、填料載體（硅膠純度、填料顆粒類型、粒徑、孔徑）、柱子本身（柱效、柱內(nèi)徑、柱長）和隱藏參數(shù)（比表面積、含碳量等）。無厘頭的小編想挑選以下幾個大家容易忽視的方面進行介紹。


1、碳含量

碳含量即填料中的含碳量，側(cè)面反映C18的修飾程度，對分離效果及目標組分的保留時間起到重要作用。對同類型的填料而言，非極性化合物在含碳量高的柱子上的保留要大于低碳含量的柱子，碳鏈增長了，也增加了鍵合相的非極性作用面積。不同的鍵合工藝決定了C18的碳含量，一般市面上C18碳含量在17-22%不等，也有些特殊C18的碳含量超過22%和低于14%的C18填料。大多數(shù)樣品選擇普通碳含量的C18就可以解決。含碳量也不是越多越好，要根據(jù)樣品性質(zhì)和純化需要去挑選不同碳含量的C18，例如極性較大的化合物在碳含量高的C18保留情況不如含碳量低的C18。


2、基質(zhì)形態(tài)、粒徑、孔徑

硅膠基質(zhì)形態(tài)通�？梢苑譃闊o定形和球形兩種。無定形C18因其性價比高，可作為初步純化的首選。而球形C18的顆粒均一性好，柱效更高，分離度更好，但相對價格可能稍高，可作為精細純化的選擇。
目前市場上可供選擇的填料粒徑有很多，中低壓制備一般為了增大上樣量、增加流速、減小壓力選用大粒徑填料；因為能達到較高的柱效，所以小粒徑填料更適用于高效液相或高壓制備。硅膠的孔徑在選擇填料時也應充分的考慮，分子量低于5000 Da時選擇孔徑（80-120Å），而對于蛋白大分子分子量20000Da左右左要選擇大孔徑（300Å），分子量大于20000Da的樣品，通常不考慮C18分離模式，選用SEC等模式分離。

3、封端

載體硅膠上的硅羥基大部分都會參與鍵合反應，但是卻不能反應完全，會有一些硅羥基裸露在外面。這些硅羥基會與極性組分起作用，使色譜峰拖尾，降低柱效。為了減少游離的硅羥基，會采用鍵合小分子的硅烷與之反應，這種叫做封端。一般采用封端技術(shù)的色譜柱，具有較高的重現(xiàn)性及耐久性，對于大多數(shù)的化合物都能有很好的分離能力。

C18反相分離柱使用中影響因素

根據(jù)樣品情況選定C18反相分離柱，我們要通過改變流動相的組成或溶劑強度來改善樣品的分離度、選擇性或保留時間。

反相C18分離中，水能與許多有機溶劑混合，如水-甲醇、水-乙腈、水-四氫呋喃等，對不同的樣品分離結(jié)果也千差萬別。在流動相中加入適當?shù)母牧紕┤缛�乙胺或乙酸，可以抑制硅膠表面殘留的硅羥基的酸性，從而減少對酸或堿性組分的保留，減少拖尾；且調(diào)節(jié)流動相的PH，對酸性或堿性組分的選擇性有很大改變。對于酸性組分來說，當流動相的PH＜7時，會增加在色譜柱上的保留時間；對于堿性樣品來說，當流動相的PH≥7時，堿性組分為游離型（RNH2），極性小、保留時間增長、在固定相與流動相之間可以多次分配，增加堿性組分的選擇性。

通常，我們需要分離的混合樣品性質(zhì)很不同，很難通過調(diào)節(jié)PH就能達到要求。一般，在改變流動相PH的基礎(chǔ)上，另加入緩沖鹽來改變組分的選擇性和分離度。在使用過程中，大部分C18反相分離柱須注意以下3個方面：

1、強酸強堿

以硅膠為載體的鍵合相填料，其使用要求為：流動相的PH值范圍在2.5-7.5之間。當PH＜2時，流動相可能會與載體硅膠和鍵合相之間發(fā)生水解反應，使碳鏈丟失；當PH＞7時，流動相可能會使載體硅膠溶蝕。所以，硅膠基質(zhì)的C18（即ODS）基本上在強堿條件下壽命較短，而聚合物C18能在較高堿性條件下穩(wěn)定運行，但其價格昂貴且分離能力和機型強度都不如ODS。

2、純水體系

鍵合相是非極性，碰到水會排斥C18鏈，從而使C18“倒伏”，色譜峰形變差，保留變?nèi)酰�即水相塌陷現(xiàn)象，因此，大部分C18反相分離柱不能用100%純水做流動相。通常選擇C18-AQ反相分離柱分離親水化合物，走純水體系，提高保留值。

3、緩沖鹽

由于分離組分的多樣性，單純使用酸或堿去調(diào)節(jié)流動相中的PH值不一定能達到實驗想要的效果。通常的做法是：用緩沖鹽配制流動相。但有一些緩沖鹽會析出不易看到的細微晶體：如果過濾，會改變流動相的組成；不過濾，晶體會損傷柱子，也容易堵塞管道、污染檢測器。因此，在滿足實驗的前提下，盡量選擇不易析出的緩沖鹽；分離結(jié)束后，務必將柱子及整個分離系統(tǒng)沖洗干凈，避免色譜生長霉菌。為了方便制備后處理，通常選擇一些易揮發(fā)的鹽類，如銨鹽。 返回小木蟲查看更多