對(duì)液相色譜來(lái)說(shuō)，色譜柱是核心。對(duì)分離純化來(lái)說(shuō)，一根高效、穩(wěn)定的色譜柱是關(guān)鍵。分離純化不同樣品，需要用到不同的柱子，今天小編想跟大家聊一聊C18反相分離柱。


C18是連接十八烷基碳鏈的反相固定相的總稱。除了常見(jiàn)的硅膠為基質(zhì)外，高聚物小球、氧化鋁、氧化鋯等為基質(zhì)鍵合C18鏈形成的反相固定相,都可以稱為" C18"。C18的種類有很多,常見(jiàn)的硅膠基質(zhì)C18通常被稱為ODS，能在純水下運(yùn)行的C18則被稱為C18-AQ。

C18反相柱的固定相是非極性固定相，流動(dòng)相極性大于固定相極性，常用溶劑一般為水和甲醇、乙腈、四氫呋喃、異丙醇等與水互溶的溶劑，適應(yīng)于分離非極性或弱極性的化合物，其樣品洗脫順序?yàn)闃悠窐O性由高到低。



C18反相分離柱應(yīng)用范圍

C18反相分離柱廣泛應(yīng)用在天然產(chǎn)物提取、醫(yī)藥合成研發(fā)以及生物制藥等多個(gè)方向。如果您的樣品極性偏大、Rf值很近，正相模式無(wú)法分開(kāi)；終產(chǎn)物要求純度98%以上、采用正相模式無(wú)法達(dá)到；在正相條件存在溶解問(wèn)題的樣品——以上情況不妨考慮采用反相C18模式進(jìn)行分離。目前C18柱因其填料鍵合技術(shù)的成熟和出色的分離能力，已成為分離純化研究人員日常接觸最多的反相柱。


C18反相分離柱的主要參數(shù)
C18分離柱的參數(shù)有很多，大致分為四個(gè)方面：鍵合相（包括修飾、封端）、填料載體（硅膠純度、填料顆粒類型、粒徑、孔徑）、柱子本身（柱效、柱內(nèi)徑、柱長(zhǎng)）和隱藏參數(shù)（比表面積、含碳量等）。無(wú)厘頭的小編想挑選以下幾個(gè)大家容易忽視的方面進(jìn)行介紹。


1、碳含量

碳含量即填料中的含碳量，側(cè)面反映C18的修飾程度，對(duì)分離效果及目標(biāo)組分的保留時(shí)間起到重要作用。對(duì)同類型的填料而言，非極性化合物在含碳量高的柱子上的保留要大于低碳含量的柱子，碳鏈增長(zhǎng)了，也增加了鍵合相的非極性作用面積。不同的鍵合工藝決定了C18的碳含量，一般市面上C18碳含量在17-22%不等，也有些特殊C18的碳含量超過(guò)22%和低于14%的C18填料。大多數(shù)樣品選擇普通碳含量的C18就可以解決。含碳量也不是越多越好，要根據(jù)樣品性質(zhì)和純化需要去挑選不同碳含量的C18，例如極性較大的化合物在碳含量高的C18保留情況不如含碳量低的C18。


2、基質(zhì)形態(tài)、粒徑、孔徑

硅膠基質(zhì)形態(tài)通�？梢苑譃闊o(wú)定形和球形兩種。無(wú)定形C18因其性價(jià)比高，可作為初步純化的首選。而球形C18的顆粒均一性好，柱效更高，分離度更好，但相對(duì)價(jià)格可能稍高，可作為精細(xì)純化的選擇。
目前市場(chǎng)上可供選擇的填料粒徑有很多，中低壓制備一般為了增大上樣量、增加流速、減小壓力選用大粒徑填料；因?yàn)槟苓_(dá)到較高的柱效，所以小粒徑填料更適用于高效液相或高壓制備。硅膠的孔徑在選擇填料時(shí)也應(yīng)充分的考慮，分子量低于5000 Da時(shí)選擇孔徑（80-120Å），而對(duì)于蛋白大分子分子量20000Da左右左要選擇大孔徑（300Å），分子量大于20000Da的樣品，通常不考慮C18分離模式，選用SEC等模式分離。

3、封端

載體硅膠上的硅羥基大部分都會(huì)參與鍵合反應(yīng)，但是卻不能反應(yīng)完全，會(huì)有一些硅羥基裸露在外面。這些硅羥基會(huì)與極性組分起作用，使色譜峰拖尾，降低柱效。為了減少游離的硅羥基，會(huì)采用鍵合小分子的硅烷與之反應(yīng)，這種叫做封端。一般采用封端技術(shù)的色譜柱，具有較高的重現(xiàn)性及耐久性，對(duì)于大多數(shù)的化合物都能有很好的分離能力。

C18反相分離柱使用中影響因素

根據(jù)樣品情況選定C18反相分離柱，我們要通過(guò)改變流動(dòng)相的組成或溶劑強(qiáng)度來(lái)改善樣品的分離度、選擇性或保留時(shí)間。

反相C18分離中，水能與許多有機(jī)溶劑混合，如水-甲醇、水-乙腈、水-四氫呋喃等，對(duì)不同的樣品分離結(jié)果也千差萬(wàn)別。在流動(dòng)相中加入適當(dāng)?shù)母牧紕┤缛�乙胺或乙酸，可以抑制硅膠表面殘留的硅羥基的酸性，從而減少對(duì)酸或堿性組分的保留，減少拖尾；且調(diào)節(jié)流動(dòng)相的PH，對(duì)酸性或堿性組分的選擇性有很大改變。對(duì)于酸性組分來(lái)說(shuō)，當(dāng)流動(dòng)相的PH＜7時(shí)，會(huì)增加在色譜柱上的保留時(shí)間；對(duì)于堿性樣品來(lái)說(shuō)，當(dāng)流動(dòng)相的PH≥7時(shí)，堿性組分為游離型（RNH2），極性小、保留時(shí)間增長(zhǎng)、在固定相與流動(dòng)相之間可以多次分配，增加堿性組分的選擇性。

通常，我們需要分離的混合樣品性質(zhì)很不同，很難通過(guò)調(diào)節(jié)PH就能達(dá)到要求。一般，在改變流動(dòng)相PH的基礎(chǔ)上，另加入緩沖鹽來(lái)改變組分的選擇性和分離度。在使用過(guò)程中，大部分C18反相分離柱須注意以下3個(gè)方面：

1、強(qiáng)酸強(qiáng)堿

以硅膠為載體的鍵合相填料，其使用要求為：流動(dòng)相的PH值范圍在2.5-7.5之間。當(dāng)PH＜2時(shí)，流動(dòng)相可能會(huì)與載體硅膠和鍵合相之間發(fā)生水解反應(yīng)，使碳鏈丟失；當(dāng)PH＞7時(shí)，流動(dòng)相可能會(huì)使載體硅膠溶蝕。所以，硅膠基質(zhì)的C18（即ODS）基本上在強(qiáng)堿條件下壽命較短，而聚合物C18能在較高堿性條件下穩(wěn)定運(yùn)行，但其價(jià)格昂貴且分離能力和機(jī)型強(qiáng)度都不如ODS。

2、純水體系

鍵合相是非極性，碰到水會(huì)排斥C18鏈，從而使C18“倒伏”，色譜峰形變差，保留變?nèi)酰�即水相塌陷現(xiàn)象，因此，大部分C18反相分離柱不能用100%純水做流動(dòng)相。通常選擇C18-AQ反相分離柱分離親水化合物，走純水體系，提高保留值。

3、緩沖鹽

由于分離組分的多樣性，單純使用酸或堿去調(diào)節(jié)流動(dòng)相中的PH值不一定能達(dá)到實(shí)驗(yàn)想要的效果。通常的做法是：用緩沖鹽配制流動(dòng)相。但有一些緩沖鹽會(huì)析出不易看到的細(xì)微晶體：如果過(guò)濾，會(huì)改變流動(dòng)相的組成；不過(guò)濾，晶體會(huì)損傷柱子，也容易堵塞管道、污染檢測(cè)器。因此，在滿足實(shí)驗(yàn)的前提下，盡量選擇不易析出的緩沖鹽；分離結(jié)束后，務(wù)必將柱子及整個(gè)分離系統(tǒng)沖洗干凈，避免色譜生長(zhǎng)霉菌。為了方便制備后處理，通常選擇一些易揮發(fā)的鹽類，如銨鹽。 返回小木蟲(chóng)查看更多