無縫克隆的方法忽視吧 因為老板就說要用雙酶切，崩:了、、

T載體骨架和目標片段太近，無法區(qū)分。連接單克隆多，很有可能是骨架載體

建議換T載體連接，或者多挑單克隆

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       1、目的片的方面考慮，因與T載體大小接近，為了避免酶切后回收過程中摻入T載體，可以適當提高瓊脂糖濃度（即提高凝膠條帶分離度），同時增加瓊脂糖凝膠的長度，增加跑膠時間，300bp的差異還是可以用凝膠分離開的，最后切膠回收目標條帶。

       2、目標載體方面考慮，不清楚樓主的目標載體是否是從空載體出發(fā)雙酶切處理的，因為空載體進行雙酶切處理，是否酶切完全是比較難以檢測的，電泳也無法判斷雙酶切均完全（常常導致大量假陽性）。

       所以我們常用的方法是用實驗室已經(jīng)驗證OK 的其他重組載體出發(fā)進行雙酶切處理，比如，你提到的已經(jīng)成功構(gòu)建了一個12K+400bp的重組載體，并且酶切位點還一致，那么你可以直接提取該重組載體質(zhì)粒出發(fā)進行雙酶切，酶切后通過電泳上是否有400bp條帶來判斷目標載體是否酶切完全，通過膠回收拿到酶切完全的目標載體片段。

       3、連接體系方面考慮，如果按上述1、2方法獲得了正確的片段與載體，那么還有一個問題要提醒的，就是膠回收后的目的條帶和載體，一定要進行電泳檢測，一方面確認經(jīng)過膠回收確實獲得了目的條帶（排除膠回收過程意外導致未拿到目的片段），另一方面可以初判片段和載體的濃度差異，為連接體系濃度比提供參考。

       當確認載體和片段回收都OK了，你提到了嘗試增加目的條帶濃度來提高連接效率，這個思路沒有問題，按經(jīng)驗甚至可以建議你盡量多的加入你的目的基因（10倍或更高），載體微量即可，因為畢竟目的基因片段過量不會對后續(xù)陽性篩選造成太大的麻煩，雖然單菌落數(shù)會比較少，但陽性率比較高。而一旦載體過量就有可能造成一些假陽性，平板長滿了菌落并不是什么好事，空載率也會很高，影響結(jié)果。

      4、轉(zhuǎn)化遺傳操作系統(tǒng)考慮，不清楚樓主實驗使用宿主菌是哪個菌屬，但12K+2.3K的重組載體也屬于比較大的重組質(zhì)粒了，可能對你的轉(zhuǎn)化方式及感受態(tài)要求會高一些，也是需要考慮的因素。

      5、陽性克隆篩選方面考慮，看樓主的問題描述，可能是使用的菌落PCR進行的陽性篩選。對于常做分子克隆的的技術人員來講，菌落PCR其準確性可靠性低于酶切驗證和測序驗證，常作為一個初篩的技術手段，換句話講就是菌落PCR陰性不一定就代表為假陽性，畢竟PCR受影響的因素比較多，我們實驗中也常常遇到菌落PCR沒有條帶，但是提質(zhì)粒酶切驗證及測序均正確的情況，后來我們基本上不使用PCR了，直接提質(zhì)粒酶切驗證，所以樓主可以嘗試對挑選的克隆進行提質(zhì)粒雙酶切驗證，這個應該是非常直觀準確的方法。
  
       當然，如果非要進行菌落PCR，可適當增加陽性對照和陰性對照，排除PCR過程中的意外因素干擾。

       這是對整個分子克隆過程主要因素分析的，希望可以為你解決難題提供思路，祝好，