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hc2015
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[交流]
蛋白的純化之離子交換層的選擇
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蛋白質(zhì)表面在溶液中一般都帶電荷，帶電荷的類型取決于蛋白質(zhì) pI 和溶液的 pH 。 pH 小于 pI 時(shí)蛋白質(zhì)帶正電， pH 大于 pI 時(shí)蛋白質(zhì)帶負(fù)電。不同的等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)在同一個(gè)溶液中，表面帶電情況不同。離子交換色譜法就是利用不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn)在同一個(gè)溶液中表面帶電情況不同實(shí)現(xiàn)分離。 近似處理中，將蛋白質(zhì)分子和交換基團(tuán)看作點(diǎn)電荷，它們之間的作用力 F 為： F=q 1 • q 2/εr 2 q 1 ， q 2 分別為蛋白質(zhì)分子和交換基團(tuán)兩個(gè)點(diǎn)電荷的電量；ε為介質(zhì)介電常數(shù)； r 為兩點(diǎn)電荷間的距離。 在離子交換色譜中交換基團(tuán)的電荷和大小是不變的，而樣品的電荷（表面帶電情況）和大小是不同的，受到交換基團(tuán)的作用力也不同，從而實(shí)現(xiàn)分離。 與凝膠色譜基質(zhì)一樣，離子交換介質(zhì)的基質(zhì)也有 3 類：交聯(lián)多糖如交聯(lián)瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖，大孔硅膠和多孔玻璃，大孔有機(jī)聚合物（聚苯乙烯等）。在蛋白質(zhì)的離子交換分離中主要使用交聯(lián)多糖，特別是交聯(lián)瓊脂糖基質(zhì)介質(zhì)，有強(qiáng)陰、弱陰、強(qiáng)陽(yáng)、弱陽(yáng) 4 種，下面為國(guó)內(nèi)外離子交換色譜介質(zhì)的名稱、基質(zhì)、交換基團(tuán)等性質(zhì)的表格。 名稱 交換基團(tuán) 基質(zhì) 應(yīng)用 強(qiáng)陰（ Q ） CH 2N +(CH 3) 3 交聯(lián)瓊脂糖 CL6B/6FF 蛋白質(zhì)分離，除內(nèi)毒素 弱陰 (DEAE) CH 2CH 2N(C 2H 5) 2 交聯(lián)瓊脂糖 CL6B/6FF 蛋白質(zhì)分離， 強(qiáng)陽(yáng) (SP) (CH 2) 3SO 4 - 交聯(lián)瓊脂糖 CL6B/6FF 蛋白質(zhì)分離 弱陽(yáng) (CM) CH 2COOH 交聯(lián)瓊脂糖 CL6B/6FF 蛋白質(zhì)分離 離子交換填料吸附量大（見(jiàn)下表），分辨率好，可用在工藝的任何一步。但是上樣時(shí)樣品溶液中鹽濃度（即離子強(qiáng)度）不能太大，否則會(huì)不保留或分辨率差。現(xiàn)在有一些新的介質(zhì)產(chǎn)品，可以允許樣品溶液有較大的鹽濃度。 名稱 交換基團(tuán) 最大吸附量（ mg/ml ） pH 工作范圍 強(qiáng)陰（ Q ） CH 2N +(CH 3) 3 120HSA 2~12 弱陰 (DEAE) CH 2CH 2N(C 2H 5) 2 110HSA 2~9 強(qiáng)陽(yáng) (SP) (CH 2) 3SO 4 - 70RNase 4~13 弱陽(yáng) (CM) CH 2COOH 50RNase 5~10 離子交換填料配基只有帶電荷才能對(duì)蛋白質(zhì)有吸附。強(qiáng)陰（ Q Bio-sep FF ）和強(qiáng)陽(yáng) (SP Bio-sep FF) 介質(zhì)的離解度很大，所以 pH 工作范圍很寬；但弱陰 (DEAE Bio-sep FF ) 和弱陽(yáng) (CM Bio-sep FF) 填料在一定的 pH 范圍內(nèi)離解， pH 工作范圍有較大的局限。（見(jiàn)上表） 弱陰 (DEAE Bio-sep FF ) 在較小 pH 值時(shí)離解度較大；而 弱陽(yáng) (CM Bio-sep FF ) 在較大 pH 值時(shí)離解度較大。強(qiáng)陰（ Q Bio-sep FF ）和強(qiáng)陽(yáng) (SP Bio-sep FF) 在溶液中幾乎完全離解，與 pH 關(guān)系不大。 蛋白質(zhì)的保留與其 pI 及溶液的 pH 值有關(guān)。 從以上兩點(diǎn)看，使用弱陰 (DEAE Bio-sep FF ) 時(shí)較小 pH 值離解度較大，但要大于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)才有保留，而 弱陽(yáng) (CM Bio-sep FF) 較大 pH 值離解度較大，但要小于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)才有保留。要兼顧離解度和保留值對(duì)溶液 pH 的要求。 弱陽(yáng) (CM Bio-sep FF ) 常在酸性下如 pH5.0 使用，此時(shí)適合 pI 大于 5.0 的蛋白質(zhì)樣品， pI 越大保留值越大。弱陰 (DEAE Bio-sep FF ) 常在堿性如 pH8.0 使用，此時(shí)適合 pI 小于 8.0 的蛋白質(zhì)樣品， pI 越小保留值越大。 |
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