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穆子涵金蟲 (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于體外轉(zhuǎn)錄的一些細(xì)節(jié)問(wèn)題，還請(qǐng)做過(guò)這方面實(shí)驗(yàn)的大神不吝賜教 已有1人參與
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最近因?qū)嶒?yàn)需要，要體外轉(zhuǎn)錄獲得一段RNA進(jìn)行相關(guān)反應(yīng)，無(wú)奈，之前并未接觸過(guò)體外反應(yīng)的相關(guān)操作，已進(jìn)行了數(shù)次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均不理想。特來(lái)版上求助有做過(guò)相關(guān)方面實(shí)驗(yàn)的大神們，希望諸位能不吝賜教，萬(wàn)分感激 需要轉(zhuǎn)錄的RNA長(zhǎng)度較短，全長(zhǎng)也才180bp左右，使用的啟動(dòng)子為各類載體上常用的T7啟動(dòng)子（TAATACGACTCACTATAGG），通過(guò)高保真PCR，后面直接接上了我的片段，以產(chǎn)物片段作為體外反應(yīng)的模板，使用的是NEB的T7 RNA聚合酶，模板用量為50uL體系加入了200ng PCR產(chǎn)物片段，100U的RNA聚合酶，NTP濃度為各0.5mM。反應(yīng)時(shí)間為37℃ 2h。后用取產(chǎn)物2.5uL 用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，僅發(fā)現(xiàn)有一條條帶，經(jīng)過(guò)對(duì)照分析，該條帶為模板DNA片段。 有如下幾個(gè)問(wèn)題，還請(qǐng)大神們能夠予以指點(diǎn)： 1. 啟動(dòng)子長(zhǎng)度是不是偏短，導(dǎo)致聚合酶無(wú)法正常附著于模板DNA上？ 2. 反應(yīng)體系中的模板用量是否偏低？因?yàn)閰⒖颊f(shuō)明書上的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，50uL反應(yīng)體系的模板用量一般在1ug左右。 3. 聚合酶的用量是否合適？ 4. 反應(yīng)時(shí)間是否充足？參看版上的一個(gè)帖子說(shuō)，片段短于200b時(shí)，反應(yīng)時(shí)間需要延長(zhǎng)，那么延長(zhǎng)多少比較合適？ 5. 如果反應(yīng)完成后想進(jìn)行聚合酶的失活，是不是高溫條件下放置數(shù)分鐘即可？ 麻煩諸位大神指點(diǎn)一二，在此先行謝過(guò)。 |
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2樓2017-05-22 13:08:23
小胖子lxm
新蟲 (初入文壇)
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3樓2019-12-16 19:46:12
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