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牧狼人1銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
pPICZαA載體表達(dá)問題
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大神們，求助一下！用pPICZαA載體表達(dá)一條曲霉的基因（2400bp左右），電轉(zhuǎn)進(jìn)GS115，做了四五次，每次都能用特異性引物從抗性平板上挑出陽性來，通用引物有時(shí)能挑出來，但挑出的陽性搖瓶后測(cè)沒有酶活，SDS-PAGE銀染后條帶特淡，不確定有沒有表達(dá)。因?yàn)榈谝淮斡眠@個(gè)載體做，也沒有經(jīng)驗(yàn)，照著說明書做的。發(fā)現(xiàn)幾個(gè)問題不知道會(huì)不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 1.電轉(zhuǎn)后涂菌體在YPDS1mg/ml的Z抗平板上，長出單菌落得3、4天，是不是Z抗失效了才長出來? 2.跟實(shí)驗(yàn)室同學(xué)一起做的，他用的是9K載體，電轉(zhuǎn)后在MD平板上也用特異性引物挑出來了，但是也沒有酶活，跑膠的蛋白也條帶很淡。特異性引物挑單菌落和通用引物挑陽性會(huì)很有差別嗎？ 3.線性化的時(shí)候，線性化后的條帶是不是比未線性化的質(zhì)粒跑的慢，因?yàn)橥瑢W(xué)的線性化后跑的比質(zhì)�？欤@個(gè)是什么原因�。� |
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