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【原創(chuàng)/翻譯】十字花科特征性代謝物的多克隆抗體表征 已有1人參與
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【短評(píng)】甲磺酰烷基硫代葡萄糖苷（methylsulfinylalky glucosinolate) 的多克隆抗體特征研究 在分子生物學(xué)的定量和定性實(shí)驗(yàn)中，利用抗體識(shí)別小分子物質(zhì)已經(jīng)成為一種重要的工具。小分子具有低免疫原效能，但通過(guò)偶聯(lián)載體分子可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)而產(chǎn)生抗體。根據(jù)這一原理，研究者發(fā)現(xiàn)了植物生長(zhǎng)素、雙吲哚生物堿、木脂素、 芥子甙和抗壞血酸等植物特異性代謝物的抗體。為了避免這些抗體與其他植物成分產(chǎn)生交叉反應(yīng)，有必要對(duì)其特異性進(jìn)行詳細(xì)的特征研究。 硫代葡萄糖苷是十字花科植物的特征之一，由氨基酸衍生的特異性代謝物。它們由一個(gè)共同的功能基團(tuán)（如硫代葡萄糖苷基團(tuán)）和 一個(gè)多變的支鏈組成，該支鏈取決于前提氨基酸，可能是氨基酸支鏈的延長(zhǎng)，也可能是硫代葡萄糖苷功能基團(tuán)形成后支鏈的裁剪。4-甲磺酰丁基硫代葡萄糖苷（4msh) 又稱(chēng)為蘿卜硫苷，是花椰菜和擬南芥含量豐富的一種甲硫氨酸衍生的脂肪族硫代葡萄糖苷。它是與減少患癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的一種重要硫代葡萄糖苷。它與花椰菜的化學(xué)預(yù)防功效相關(guān)，并且存在于擬南芥中，由此成為了熱門(mén)的研究對(duì)象。 最近的研究已經(jīng)表征了4msb-BSA 偶聯(lián)物多克隆抗體的特異性和效價(jià)，更詳細(xì)的離體表征采用野生型和生物合成突變型擬南芥的植物提取物來(lái)確認(rèn)甲硫氨酸衍生的脂肪族硫代葡萄糖甘的亞磺�；ф溈贵w的特異性。這些抗體是非常有效的分析工具，在不同的研究中都有重要的應(yīng)用，比如研究植物體中4msb的免疫細(xì)胞化學(xué)分布和美聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）等。4msb（由丹麥的 C2 bioengineering Aps提供）偶聯(lián) BSA 的多克隆抗體由法國(guó)的 Gemacbio 公司（http://gemacantibodies.com/）制備。在點(diǎn)印跡分析（dot blot analysis) 中，取10微升的10mM 硫代葡萄糖苷溶液與甲醇活化的 PVDF 膜雜交，風(fēng)干后用5%脫脂乳 PBS 溶液處理2小時(shí)來(lái)封閉。經(jīng)過(guò)第一抗體（1：2000稀釋?zhuān)?攝氏度孵育過(guò)夜后，雜交膜用 PBS 緩沖液沖洗兩次，然后用1：1000稀釋比的山羊源抗兔抗體（Thermo Scientific 公司的穩(wěn)定型HRP 二抗）室溫下孵育1小時(shí)來(lái)進(jìn)行免疫檢測(cè)。 雜交膜用 PBS 緩沖液沖洗兩次。采用高信號(hào)值的硬腦膜免疫化學(xué)發(fā)光底物（Thermo Scientific公司）和“ChemiDoc“免疫成像系統(tǒng)（Bio-Rad 公司）進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。芥子甙（烯丙基硫代葡萄糖苷）、4-甲基三丁基硫代葡萄糖苷（4mtb)、3-甲硫�；虼咸烟擒眨�3msp) 和脫磺基4msb購(gòu)買(mǎi)自 C2 bioengineering Aps 公司（www.glucosinolates.com/profile.aspx)。 野生型擬南芥、生物合成的 無(wú)義突變型擬南芥（myb28 myb29 cyp79B2 cyp79 B3, 命名為 qKO）、脂肪族生物合成無(wú)義突變型擬南芥（mybmyob8 myb29）和煙草的種子種在含有植物基質(zhì)（丹麥 Pindstrup Mosebrug A/S 公司）的4厘米小盆中。種子經(jīng)過(guò)2天的4攝氏度冷處理后，放入人工培養(yǎng)箱中。擬南芥的生長(zhǎng)環(huán)境為16小時(shí)光照、20攝氏度、濕度70%和100uE 光密度。煙草的生長(zhǎng)環(huán)境為16小時(shí)光照、24攝氏度、濕度70%和100-120光密度。從成熟開(kāi)花的無(wú)斑點(diǎn)植物上采集3片葉子（約2mg），并加800微升的85%甲醇勻漿。2500xg 離心10分鐘后，取上清，用快速真空器定容為約500微升后過(guò)濾。只有新鮮葉片制備的提取物才會(huì)產(chǎn)生好的信號(hào)。點(diǎn)印跡法需要10微升植物提取物，除了第一次采用脫脂乳封閉外，雜交膜還要用0.05%的山羊血清（Sigma-Aldrich 公司）室溫孵育1小時(shí)。這個(gè)額外的封閉步驟是嚴(yán)格優(yōu)化的結(jié)果。 在分布表征4msb-BSA 偶聯(lián)的多克隆抗體過(guò)程中，首先選擇一個(gè)合適于點(diǎn)印跡分析的雜交膜，確�？贵w與純化 的4msb 的反應(yīng)活性。取10微升的10mM 4msb溶液、4msb-BSA偶聯(lián)物溶液和10mg/ml 的 BSA 溶液與硝化纖維膜和聚偏二氟乙烯（PVDF）膜雜交。相比于硝化纖維膜，PVDF 膜與硫代葡萄糖苷的雜交效果更好。這可能因?yàn)?PVDF 膜有更高的結(jié)合能力（150-160ug/cm2) 和更小的孔徑（0.2um)， 相比于硝化纖維膜（80-100ug/cm2, 0.4um)�？贵w與4msb-BSA偶聯(lián)物和4msb 的反應(yīng)都能獲得好信號(hào)，而 BSA 沒(méi)有檢測(cè)到雜交反應(yīng)活性（圖1a）。該結(jié)果表明，抗體特異性識(shí)別4msb 的抗原決定簇而不是偶聯(lián)的 BSA。抗體識(shí)別4msb 的敏感性和檢測(cè)極限的研究，通過(guò)已知濃度的4msb滴定測(cè)量抗體，或反之。當(dāng)用稀釋梯度從1:100到1:100,000的抗體識(shí)別10mM 的4msb 時(shí)，稀釋比從1：100直到30,000的抗體都能夠檢測(cè)到信號(hào)(圖1b)。因此，除非特別說(shuō)明，后面的分析都采用1：2000稀釋比的抗體。在互換的的實(shí)驗(yàn)中，濃度從1uM 到10mM 的10微升4msb用1：2000稀釋的抗體檢測(cè)�？贵w能夠識(shí)別的最低濃度為50uM，相當(dāng)于2微克的4msb（圖1c)。 當(dāng)4msb 的濃度低于25uM 時(shí)，抗體無(wú)法識(shí)別。該結(jié)果表明，在指定實(shí)驗(yàn)條件下，抗體識(shí)別4msb具有高靈敏性。 抗體的雜交反應(yīng)活性通過(guò)識(shí)別不同的甲硫氨酸衍生的脂肪族硫代葡萄糖苷和其他衍生物來(lái)檢測(cè)，包括4-甲基三丁基硫代葡萄糖苷（4mtb）、2-烯丙基硫代葡萄糖苷（芥子甙）、去硫化4msb（脫磺基4msb）和3-甲磺�；；虼咸烟擒眨�3msp）（圖2a）。含有甲硫酰基支鏈的3msp和4msb 都檢測(cè)到好的信號(hào)，這表明抗體識(shí)別甲硫�；鶊F(tuán)，并且與鏈的長(zhǎng)度無(wú)關(guān)（圖2）。脫磺基4msb 和4msb 的信號(hào)強(qiáng)度相同，這說(shuō)明抗體并不識(shí)別硫代葡萄糖苷功能基團(tuán)的磺基部分。4mtb 只能檢測(cè)到很低的雜交反應(yīng)活性，它與4msb 在結(jié)構(gòu)上的不同之處在于，含有一個(gè)甲基三丁基基團(tuán)，而不是在丁基支鏈的末端有一個(gè)硫氧化的甲磺�；鶊F(tuán)。芥子甙沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)，這說(shuō)明抗體不識(shí)別硫代葡萄糖苷功能基團(tuán)的抗原決定族�？偠灾�，抗體特異性識(shí)別甲磺酰烷基硫代葡萄糖苷末端的甲磺酰基基團(tuán)。因此，結(jié)果表明抗體可能用來(lái)檢測(cè)含有不同長(zhǎng)度的甲磺酰烷基支鏈的硫代葡萄糖苷。 為了進(jìn)一步確認(rèn)抗體識(shí)別脂肪族硫代葡萄糖苷的特異性，采用野生型擬南芥以及不含脂肪族硫代葡萄糖苷（myb28 myb29)或即不含脂肪酸也不含吲哚硫代葡萄糖苷（qKO）的突變型擬南芥的提取物進(jìn)行試驗(yàn)。煙草葉片的提取物用來(lái)檢測(cè)非十字花科植物代謝物與抗體的雜交反應(yīng)活性。野生型擬南芥提取物能夠檢測(cè)到信號(hào)，而陰性對(duì)照（qKO、myb28 myb29和煙草）都沒(méi)有信號(hào)。該結(jié)果確認(rèn)抗體僅僅檢測(cè)甲磺酰烷基硫代葡萄糖苷�？贵w與植物提取物中的甲硫氨酸亞砜等其它結(jié)構(gòu)類(lèi)似代謝產(chǎn)物沒(méi)有雜交反應(yīng)活性，這與抗體將在植物體中的應(yīng)用至關(guān)重要。 抗體在離體實(shí)驗(yàn)中顯示出良好的反映效果，這預(yù)示著有希望于用來(lái)在不同的植物組織中定位硫代葡萄糖苷。早前的一個(gè)關(guān)于硫代葡萄糖苷亞細(xì)胞免疫定位的研究缺乏了對(duì)所用抗體的全面性特性研究。而本文研究的抗體結(jié)合使用硫代葡萄糖苷缺失突變體作為陰性對(duì)照，可以在植物體重免疫定位甲磺酰烷基硫代葡萄糖苷。 簡(jiǎn)而言之，本文對(duì)甲磺酰烷基硫代葡萄糖苷的特異性抗體做了一個(gè)詳細(xì)的離體特征研究。該抗體提供了一個(gè)非常有價(jià)值的工具，可以用于 ELISA 分析等定量和定性實(shí)驗(yàn)。此外，親和色譜法和蛋白質(zhì)體外結(jié)合分析（pull-down assays)再加上詳細(xì)表征的抗體，可以增進(jìn)對(duì)代謝產(chǎn)物-蛋白質(zhì)互作和植物硫代葡萄糖苷蛋白互作的理解。 |
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2016-03-12 23:19:22, 747.38 K
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Sangthong S, Weerapreeyakul N. Simultaneous quantification of sulforaphene and sulforaphane by reverse phase HPLC and their content in Raphanus sativus L. var. caudatus Alef extracts.[J]. Food chemistry, 2016, 201. Ares A M, Nozal M J, Bernal J L, et al. Optimized extraction, separation and quantification of twelve intact glucosinolates in broccoli leaves.[J]. Food Chemistry, 2014, 152(2):66-74. |
4樓2016-03-30 09:52:01
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