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【技術(shù)貼】引物設(shè)計究竟該怎么設(shè)計？才能保證在PCR芯片或qPCR實(shí)驗(yàn)中的特異性！
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在熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中，引物至關(guān)重要，設(shè)計的成功與否，關(guān)乎整個實(shí)驗(yàn)的成敗。各位站友在進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)時遇到的各種問題，也往往由引物設(shè)計不當(dāng)引起。我們是研發(fā)PCR芯片的團(tuán)隊(duì)，對qPCR實(shí)驗(yàn)中引物設(shè)計有獨(dú)特的見解和解決方法，現(xiàn)在與大家來分享，希望對大家的實(shí)驗(yàn)有所幫助！ 以往的熒光定量PCR中引物設(shè)計都基于以下幾個原則： • 引物的 GC 含量為 50–60% • 熔解溫度(Tm) 在 50ºC-65ºC 之間 • 避免產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)，必要時引物結(jié)合位置設(shè)計在目標(biāo)序列二級結(jié)構(gòu)區(qū)域之外 • 避免超過 3 個 G 或 C 重復(fù)片段 • 引物末端堿基為 G 或 C • 檢查正向和反向引物確保 3' 沒有互補(bǔ)配對（避免引物二聚體形成） • 用BLAST等軟件來檢驗(yàn)引物的特異性 以上都是必須滿足的條件，但如果要在更多的實(shí)驗(yàn)樣本中實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增結(jié)果的特異性和一致性，我們發(fā)現(xiàn)這些要素并不能很好的解決所有問題，就要再引入獨(dú)特的設(shè)計理念。 我們的獨(dú)特的引物設(shè)計理念總結(jié)如下： a. 引物設(shè)計涵蓋該基因的所有轉(zhuǎn)錄本，完整定量一個基因的表達(dá)； b. 引物不含SNP位點(diǎn)，不會因?yàn)閭�體基因多樣性而導(dǎo)致定量差別； c. 引物不會位于基因組重復(fù)序列內(nèi)； d. 引物專一性得到BLAST分析的驗(yàn)證，絕大多數(shù)引物在目標(biāo)序列與非目標(biāo)序列相差3個堿基以上； e. 絕大多數(shù)引物設(shè)計跨越剪接區(qū)域，只擴(kuò)增成熟mRNA，極大程度避免RNA樣品中殘余基因組DNA對體系的影響； f. 建立引物數(shù)據(jù)庫，統(tǒng)計每對引物Tm值的置信區(qū)間，以監(jiān)控引物是否正常運(yùn)行。 簡單說來，①. b, c, d等原則是為了保證引物在大量樣本中的特異性；②. a, e, f等原則是為了保證引物在大量樣本中的一致性。 希望我們的這些信息對大家的實(shí)驗(yàn)有所幫助！歡迎大家與我討論相關(guān)問題，或?qū)栴}發(fā)到我的郵箱tangchen@ctbioscience.com（江蘇楚天生物）。 |
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