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連接T載體成功后發(fā)現(xiàn)連的不是目的基因 已有2人參與
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首先，我們的基因是從基因組文庫中拿到的。 第一步做PCR擴(kuò)增， 采用的是25ul的反應(yīng)體系，引物為xho1和Bamh1，各取0.5ul,模版0.25ul，2*taq22.5ul，dd水11.25ul 過程是30個(gè)循環(huán)，95度3min,95度30s,53度30s,72度2min,,72度10min,4度keep 跑膠后結(jié)果有一些雜帶，其中有一條是小于500bp,我們的目的基因是1800多bp, 第二步是瓊脂糖凝膠回收了1800bp的那條帶， 第三步是連接T載體過夜，（T載體是takara的pmd 18-t vector cloing kit） 第四步是轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)然后涂板（氨芐） 然后長出來了點(diǎn)，我挑了五個(gè)點(diǎn)，然后用PCR產(chǎn)物做正對照，目的基因的兩條引物，發(fā)現(xiàn)跑出的條帶均為不足500bp的， 接著我還是再用那五個(gè)點(diǎn)，用t載體的引物，發(fā)現(xiàn)跑出的仍然為500bp Des_splash.png |
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張凡云
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2樓2016-03-29 23:01:04
張凡云
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