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[求助]
求助！我的空白對照組老是有條帶！
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大家好，先說說我實(shí)驗(yàn)的情況。我的對照組是真核表達(dá)載體pJW4303，實(shí)驗(yàn)組是pJW4303-NSs-FLAG，目的質(zhì)粒是選取的某個(gè)病毒的基因片段，可以分泌目的蛋白NSs。目的蛋白大小34KD。把上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞后收集上清和裂解，-20度保存。 WB的目的是驗(yàn)證NSs這個(gè)蛋白在細(xì)胞中是否表達(dá)。因?yàn)檫@個(gè)蛋白沒有商品化的抗體，所以我們之前的一抗都是用的小鼠免疫的血清（相當(dāng)于多克隆抗體），做出來的條帶有很多雜帶，而且空載體的裂解里在目的蛋白位置也有條帶，重新轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒也還是這個(gè)結(jié)果，當(dāng)時(shí)認(rèn)為是非特異性條帶。我們的解決方法是在目的質(zhì)粒上加了個(gè)FLAG（之前的目的質(zhì)粒都是pJW4303-NSs），重新轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集上清和裂解，用的一抗是鼠源的anti-FLAG單克隆抗體（1：5000），二抗是羊抗鼠的IgG（H+L）（1：10000），曝光后空載體組還是有條帶。。。于是我懷疑轉(zhuǎn)染的時(shí)候污染了，又用以前轉(zhuǎn)染的4303跑（濃度稍微低點(diǎn)）還是可以看到目的蛋白位置有比較淡的條帶，真的不知道是怎么回事啊啊？有沒有大神幫幫我啊，我做了差不多大半年了就是跑不出。 附圖： 一抗用的血清，1：300 內(nèi)參β-actin，大小43kD，1：1000 一抗鼠源anti-FLAg，1：5000 |
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030Selma
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3樓2016-07-26 10:00:46
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