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[求助]
最近一直在純化HIS標(biāo)簽蛋白，用的是sf9細(xì)胞表達(dá)，老是出問題.。。。 已有1人參與
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實驗室用的sf9細(xì)胞裂解液配方：20mM的Tris-cl(PH7.8), 0.5mM EGTA 1mM EDTA 1M Mgcl2 10%甘油 200mM 氯化鈉 0.5% NP40 HIS-wash :50mM磷酸鹽緩沖液（ph8.0） 500mM氯化鈉 10%甘油 1%Triton-100 20mM咪唑 HIS-Elution:250mM咪唑，其他和WASH一樣 對于sf9細(xì)胞裂解液里邊為何同時加EDTA和鎂離子，有點搞不懂。還有就是氯化鈉的濃度是不是��？ 對于以上三種溶液可不可以加一些DTT或者β-巰基乙醇，濃度是多少呢？ 100ml的培養(yǎng)基離心后獲得細(xì)胞加入了5ml裂解液（相應(yīng)l體積的PMSF），超聲裂解，冰上30min，離心得上清，用 2倍體積上清的wash buffer和上清混勻后，4度和beads孵育過夜（原300ml培養(yǎng)基得到的細(xì)胞，用1了ml的beads,少嗎？） 20mM咪唑，250mM分別洗柱子，最后抗體，考然檢測有些目的蛋白甚少（要純化5亞基復(fù)合物，只有一個亞基帶了HIS標(biāo)簽），是蛋白本身表達(dá)量少還是所用BUFFER不合適呢？ 還有就是如何確定這個多亞基蛋白的PI呢？ 折騰了一兩個月了，被老板熊，，，，，哎 著急呀  。還請各位蟲友支支招呀�。。。。。。。�！@gyesang@hc-material |
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柱子說明書中EDTA的濃度不能超過多少？我覺得EDTA會影響his tag的結(jié)合 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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2樓2016-05-18 09:04:28
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
ivirus: 金幣+10, ★★★很有幫助 2016-05-18 20:20:55
ivirus: 金幣+56 2016-05-19 21:26:48
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1.你沒發(fā)電泳圖，我們也不能判斷是表達(dá)上的問題，還是純化上的問題。 2.裂解液建議你用平衡BUF.加EDTA會影響鎳柱的。 3.加DTT可以，萬分之一就可以了。 4.1mlbeads的吸附量大概40mg蛋白。根據(jù)你的目標(biāo)蛋白含量自己計算。 5.測蛋白的PI可以用雙向電泳法。 祝順利。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
3樓2016-05-18 13:38:19
4樓2016-05-18 19:50:58
5樓2016-05-18 20:04:16
送紅花一朵 |
1.不好意思，MARKER其中一個條帶給標(biāo)錯了，里邊第二條紅色的MARKER是50K。 2.參照一些網(wǎng)友寶貴的建議，稍作修改，您看這些配方可以嗎？ SF-9細(xì)胞裂解液：50mM phasphate buffer ,pH8.0 300mM 氯化鈉 10mM 咪唑（10-20mM之間可調(diào)） 20mM β-ME 10% 甘油 1% Triton X-100 0.5% NP-40 WASH buffer: 50mM phasphate buffer ,pH8.0 500mM 氯化鈉 10% 甘油 1% Triton X-100 20mM 咪唑 Elution buffer: 50mM phasphate buffer ,pH8.0 500mM 氯化鈉 10% 甘油 1% Triton X-100 250mM 咪唑(100-250mM之間可調(diào)) 3.我們實驗室的做法是，先裂解sf9昆蟲細(xì)胞（里邊加相應(yīng)的PMSF），收上清，將上清和兩倍其體積的Wash buffer混勻，接著加入經(jīng)10%BSA（終濃度1%）孵育過的Ni-NTA beads，4度摩天輪過夜，第二條將beads裝柱，接著wash 和Elute，收集餾分。 您看這個beads需要BSA提前封閉孵育嗎? 假如換用以上新的buffer配方，裂解液可以直接與beads混合嗎？我擔(dān)心裂解液粘度大會影響Pr與beads的結(jié)合 您提到了平衡buffer是？ |
6樓2016-05-18 20:19:19
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