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六界玄靈鐵桿木蟲 (正式寫手)
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[求助]
絕對定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制問題 已有1人參與
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剛開始做功能基因的絕對定量，目的基因確定導(dǎo)入質(zhì)粒中，也經(jīng)過普通PCR驗(yàn)證過，擴(kuò)增沒有雜帶，擴(kuò)增曲線還可以，但是熔解曲線不知道是什么情況，后期做的一次擴(kuò)增曲線比上圖還要好，熔解曲線前一部分沒有任何雜峰，最后出現(xiàn)的峰圖不知道什么意思，請大神不吝賜教！謝謝啦 捕獲1.PNG 捕獲.PNG@biostar2009@飛約瘋?cè)嗽?/u>@wizardfan@youlinglyw |
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【答案】應(yīng)助回帖
| 溶解曲線出現(xiàn)雙峰表示擴(kuò)增特異性不好，可能是引物設(shè)計(jì)存在問題我覺得一般引物設(shè)計(jì)時特異性沒有問題，只是理論，關(guān)鍵要看實(shí)踐。我覺得你可以嘗試提高退火溫度，但是這樣可能會導(dǎo)致CT值略晚出現(xiàn)，我?guī)熃闼麄儗?shí)驗(yàn)室用BIOGHC ELITEFAST SYBR KIT擴(kuò)增GAPDH基因的一個片段，他們當(dāng)時也出現(xiàn)了溶解曲線有雙峰，通過提高退火溫度來調(diào)整優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件 |
4樓2019-03-25 13:41:04
qx4117
銀蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1044.9
- 紅花: 1
- 帖子: 220
- 在線: 98.3小時
- 蟲號: 1996696
- 注冊: 2012-09-12
- 專業(yè): 環(huán)境微生物學(xué)
，想問一下樓主質(zhì)粒濃度是多少，稀釋的梯度又是多少，不勝感激。 2樓2018-01-03 15:47:00
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