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[求助]
請問感受態(tài)怎么制備 已有2人參與
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做轉(zhuǎn)化中，感受態(tài)已經(jīng)用的差不多了，想自己制備一些，省的買了，求一成功率較高的方法，或者是CaCl2 法的具體步驟，多謝！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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E.coli感受態(tài)細(xì)胞的制備（CaCl2法） 一、準(zhǔn)備 1．高壓滅菌50毫升，15毫升離心管；180℃高溫滅菌100毫升血清瓶7個(gè)，25毫升血清瓶1個(gè)，100毫升、20毫升量筒或容量瓶各1個(gè)，150毫升、50毫升燒杯各1個(gè)，搖菌用150毫升錐形瓶1個(gè)。甘油滅菌。10ml移液管3支。 2．制備滅菌水約1000毫升。 3．制備不含氨芐的LB液體培養(yǎng)基500ml；制備不含氨芐的LB培養(yǎng)基平板1-3塊。 4．配置1M NaOH 以調(diào)節(jié)pH用。 5．制備針式過濾器2個(gè)，60ml、20ml 一次性注射器各一個(gè)。 6．冷凍離心機(jī)換50ml轉(zhuǎn)子。 7．按下表配置TFB1、TFB2溶液。 嚴(yán)格按照表中順序加溶液，配制工作液，再調(diào)pH值，過濾除菌，4℃儲(chǔ)存。 TFB1（終體積：100ml） MES（0.5M）: 2ml KCl（1M）: 10ml CaCl2?2H2O（1M）: 1ml MnCl2?4H2O（0.5M）: 10ml TFB2 （終體積：20ml） MOPS（1M）： 0.2ml CaCl2?2H2O（1M）: 1.5 ml KCl（1M）: 10ml 甘油（50%）： 6ml 成分 分子式 分子量 儲(chǔ)存濃度 儲(chǔ)存液準(zhǔn)備 MES C6H13NO4S 195.2 0.5M 9.76g/100ml 氯化鉀 KCl 74.55 1M 7.455g/100ml 氯化鈣（二水） CaCl2?2H2O 147.02 1M 14.702g/100ml 氯化錳（四水） MnCl2?4H2O 197.91 0.5M 9.8955g/100ml MOPS C7H15NO4S 209.27 1M 20.927g/100ml 甘油 50% 50ml/100ml 注：1、MES為：2-N-Morpholino-ethanesulfonic Acid,即2-（N-嗎啡啉）乙磺酸。不易溶，配制時(shí)用NaOH調(diào)pH至6.2。 2、MOPS為：3-N-Morpholino propanesulfonic Acid,即3-（N-嗎啡代）丙磺酸。 3、嚴(yán)格按順序加溶液，配制TFB1工作液，用1M NaOH 調(diào)pH值至5.8，用針式過濾器過濾除菌，4℃儲(chǔ)存。 4、嚴(yán)格按順序加溶液，配制TFB2工作液，用1M NaOH調(diào)pH值至6.5，用針式過濾器過濾除菌，4℃儲(chǔ)存。 （如果上述pH值在一開始時(shí)就偏堿，可以用冰乙酸回調(diào)） 二、操作步驟： 全過程冰上4℃操作，4℃離心，無菌操作。 劃板。挑取宿主菌，在AMP-的LB瓊脂糖培養(yǎng)基平板上劃線，37℃培養(yǎng)16h。 1、 從過夜培養(yǎng)的不含氨芐的LB平板上挑單個(gè)大菌落，接種到5毫升LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，振蕩培養(yǎng)過夜。 2、 按1：100將500ul培養(yǎng)物接種到50毫升不含氨芐、預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，振蕩培養(yǎng)至OD600=0.45～0.5（約需2～2.5小時(shí)）。 3、 0℃（冰上）預(yù)冷15分鐘。 4、 4000rpm，5分鐘，4℃離心收集菌體。棄上清，用15ml TFB1懸浮菌體（渦旋振蕩）。冰上放置15分鐘。準(zhǔn)備1.5毫升離心管30個(gè)，冰上預(yù)冷。 5、 4000rpm，5分鐘，4℃離心收集菌體。棄上清，用3ml TFB2懸浮菌體（渦旋振蕩）。冰上放置15分鐘。 6、 按100ul/管，將細(xì)菌在冰上分裝到預(yù)冷的離心管（1.5ml）中，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱儲(chǔ)存。 注：用質(zhì)粒驗(yàn)證感受態(tài)細(xì)胞。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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qhiv64樓2016-05-23 23:58:16
2樓2016-05-23 22:06:32
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3樓2016-05-23 23:47:40
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8樓2016-05-24 08:53:18
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