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[交流]
體液直接PCR產(chǎn)生引物二聚體，小老板拒絕承認(rèn)是Primer dimer 已有20人參與
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各位老師， 本人德國某高校小博一枚。 課題是在人體某體液中直接進(jìn)行PCR（一般情況下體液中有很多PCR抑制物，需要核酸提取過程）， 本人利用一種特殊的酶并對PCR體系進(jìn)行優(yōu)化基本實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗?zāi)繕?biāo)，如圖lane 1-7 分別為：ladder；NTC； 50%-10% V/V 體液， 產(chǎn)物234 bp， ladder 50bp。 跟小老板討論時，他說凝膠下端的條帶是什么？ 我說是引物二聚體。 他說no no no， 他的理由是：我用的引物長度都是25 bp， 所以引物二聚體長度應(yīng)該小于50 bp （我的產(chǎn)物長度大概70 bp）。 另外他說下側(cè)產(chǎn)物信號很強(qiáng)，不像引物二聚體，而像是非特異性的產(chǎn)物 （他認(rèn)為酶在生產(chǎn)提純過程中會殘留E。coli genomic DNA， 可能與我用的人的引物反應(yīng)，產(chǎn)生了這個條帶）。 另外在no template control 中為什么會有條帶產(chǎn)生呢？ 如果我是reviewer， 我不會接收這個工作的。 你有兩個選擇： 要么去除，要么解釋�。�！ 之后我查找文獻(xiàn)， 發(fā)現(xiàn)有文獻(xiàn)報道我所用的酶的一個disadvantage就是primer dimer accumulation。 我拿著文獻(xiàn)去找小老板，他說文獻(xiàn)中下側(cè)的條帶沒有我的那么強(qiáng)。 你的更像非特異性產(chǎn)物。 。。 然后我對引物濃度進(jìn)行了梯度測試 0.1um；0.2um；0.3um；0.4um；0.5um each primer。 下側(cè)條帶隨著引物濃度降低，強(qiáng)度變小。 他又說引物濃度變小，能跟E。coli genomic DNA 結(jié)合的引物就少了，所以這不能證明下側(cè)為引物二聚體。。。 下面我打算用大腸試一下，看看是否會和我用的人類的引物反應(yīng)（我感覺根本就是放屁， 都用primer-blast查過的） 不然就只能測序了 想請問各位老師，您們認(rèn)為這是引物二聚體嗎？ 另外有什么辦法能夠充分說明他是引物二聚體嗎？ 謝謝大家的耐心 祝好 20160509_0428 edta blood_blood factor_6mm_60 degree_45S.jpg |
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5樓2016-05-26 23:35:53
6樓2016-05-27 00:15:12
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原海亮
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2樓2016-05-25 23:30:49
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8樓2016-05-27 06:45:30
32樓2016-05-30 15:40:59
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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如果要論證，其一加做一組實(shí)驗，模板采用切膠回收帶，此外對照組不加模板，其它條件一致，根據(jù)條帶結(jié)果分析。還糾結(jié)直接切膠測序 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2016-05-27 07:36:54
10樓2016-05-27 07:39:55
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