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xincer木蟲 (小有名氣)
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[交流]
關(guān)于多重PCR
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有關(guān)于多重PCR的問題想請教一下各位： 1.多重PCR中不同基因的擴(kuò)增效率不同是否會(huì)影響結(jié)果的可信性？這是否是除了引物二聚體外影響多重PCR結(jié)果的最大因素？ 2.如果是。引物的長短及Tm 值是不是應(yīng)該要求一致；擴(kuò)增產(chǎn)物長短是不是也應(yīng)該要求一致？ 3.如果擴(kuò)增產(chǎn)物的長短一致，那該如何從電泳圖分辨產(chǎn)物呢？ 4.不同基因的初始量的不同會(huì)不會(huì)影響他們的擴(kuò)增效率；或者說，不同基因初始量的不同導(dǎo)致的對原料的使用率不同，這會(huì)不會(huì)影響另一個(gè)基因的擴(kuò)增效率？ 第一次做多重PCR，這幾個(gè)問題搞不懂。 設(shè)想是不是應(yīng)該在多重PCR之前分別做不同基因的擴(kuò)增效率驗(yàn)證？ |
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| 頂 |
2樓2016-05-26 15:38:38
 本帖僅樓主可見 |
3樓2016-05-26 15:57:29
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4樓2016-05-26 16:13:57
xincer
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5樓2016-05-27 12:45:40
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6樓2016-05-27 13:24:07
lemmontree
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7樓2016-05-27 23:04:57
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引物TM要求一致的，長度不要求，你可以參考一下Qiagen的多通道PCR試劑盒說明書。里面有些參數(shù)可以參考。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2016-05-28 13:44:34
armigera
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1. 理論上不同的擴(kuò)增效率會(huì)影響結(jié)果，但都是一個(gè)反應(yīng)體系，我們認(rèn)為他們擴(kuò)增效率一致。所以結(jié)果是具有可重復(fù)性的。2. 引物的tm值盡量一致，保證與目的基因結(jié)合的效率一致。但這只是理論值，實(shí)際情況要看實(shí)驗(yàn)情況，要摸條件。3. 只要延伸時(shí)間足夠，擴(kuò)增產(chǎn)物的長短沒有影響，長短可以不一致。4. 只要多重都在指數(shù)期，兩者不會(huì)有太多影響。不過往往是，一個(gè)平臺(tái)期一個(gè)指數(shù)期沒法比較，所以條件還要摸。 傳統(tǒng)的跑電泳檢測多重pcr的方法已經(jīng)過時(shí)了，建議采用多重?zé)晒舛縫cr比較準(zhǔn)確。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2016-05-28 14:26:50
xincer
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謝謝老師，我還有一個(gè)問題。就是不同基因的初始量不同是否也會(huì)影響擴(kuò)增效率？因?yàn)闈舛雀叩幕驎?huì)和濃度低的基因進(jìn)行原料的競爭，濃度越高競爭越大這會(huì)影響結(jié)果嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
10樓2016-05-28 16:33:23
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