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PCR-SSCP原理和操作步驟
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原理 PCR-SSCP是1989年日本Orita等創(chuàng)建的篩查突變的新技術(shù)。它是一種簡單、快速、經(jīng)濟(jì)的點突變篩查手段。PCR-SSCP技術(shù)的基本原理是PCR擴(kuò)增后的DNA片段經(jīng)變性成單鏈DNA，單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時形成不同的立體構(gòu)象，其構(gòu)象直接影響泳動速率，相同長度的 DNA單鏈其核苷酸順序僅有單個堿基的差別，就可以產(chǎn)生立體構(gòu)象的不同，造成泳動速率的不同，產(chǎn)生不同的泳動帶。 PCR擴(kuò)增后的DNA片段經(jīng)變性成單鏈后在不含有變性劑的中性膠中電泳，與正常比較出現(xiàn)泳動帶的變位即可推測存在堿基置換。其堿基置換的性質(zhì)必須經(jīng)過DNA測序才能確定。因此PCR-SSCP檢測是測序之前突變篩查的常用手段。 為了便于觀察分析結(jié)果，PCR擴(kuò)增體系中常加入a-32P dNTP標(biāo)記PCR產(chǎn)物，電泳后放射自顯影觀察泳動帶的位置。目前也常用銀染法來染色聚丙烯酰胺凝膠上的DNA泳動帶，此方法可避免同位素的污染及對操作者的輻射損傷，但其靈敏度不如用同位素標(biāo)記。 單鏈DNA片段的立體構(gòu)象主要與堿基序列相關(guān)，但也受到其他條件的影響。因此，PCR-SSCP技術(shù)的關(guān)鍵在于電泳時的諸多條件，如凝膠的組成、電泳的溫度、離子濃度以及影響分子內(nèi)相互作用的其他溶質(zhì)等。 PCR-SSCP的缺點是存在假陰性和假陽性，一般對長度不超過300bp的待測片段的檢出率為70~80%。 步驟 1. PCR反應(yīng)（同前） PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳確認(rèn)。 2. PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物加10μl甲酰胺上樣緩沖液混勻，98℃ 變性10分鐘，迅速冰浴。 3. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。 （1）制備50 ml 6%非變性聚丙烯酰胺凝膠，加 TEMED 25 μl、10%過硫酸銨250 μl，混勻后灌膠，插入加樣梳子。待膠完全聚合后，拔出加樣梳子，安裝電泳裝置，加入1′TBE電泳緩沖液，緩沖液應(yīng)高于加樣孔上緣，用注射器吸取緩沖液沖凈加樣孔。 （2）取已變性的5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加到點樣孔中，以20 V/cm 電泳 4~5小時。 （3）拆下電泳裝置，取出聚丙烯酰胺凝膠，放到一個塑料盤內(nèi)，用蒸餾水沖洗1~2遍。 （4）倒入固定液，固定 8~10分鐘。 （5）用蒸餾水沖洗1~2遍；倒入銀染液，銀染10~12分鐘。 （6）用蒸餾水沖洗若干遍；倒入顯色液，顯色至出現(xiàn)清晰的銀染帶。 （7）用蒸餾水浸泡聚丙烯酰胺凝膠，觀察PCR-SSCP結(jié)果。 708F.tmp.jpg |
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